PALB2基因遗传多态性在早发性乳腺癌中的作用

宋传贵 傅芳萌 吴雪英 林舜国 王川

福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建 福州 350001

早发性乳腺癌(发病年龄≤35岁)属于具有遗传倾向的乳腺癌人群，易感性基因BRCA1或BRCA2基因的胚系突变只能解释其中不足10%的人群［1］，其余的则涉及众多低外显易感基因位点［2］。PALB2(partner and localizer of BRCA2)基因为乳腺癌易感基因BRCA2细胞核内定位、转移和稳定的协同因子，可促进BRCA2的DNA修复功能和细胞周期调控，从而保持基因组稳定性［3］。有研究表明，PALB2基因的胚系突变不但增加西方人群的乳腺癌发病风险［4］，而且，其部分单核苷酸多态性(SNP)位点可以影响散发性乳腺癌的易感性［5-6］。本研究以福建地区早发性乳腺癌为研究对象，探讨PALB2 rs249954、rs447529及rs16940342多态性位点的分布及是否可将其作为乳腺癌的低外显率易感基因位点的可能性。

1 资料和方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选择福建医科大学附属协和医院2006年1月—2010年6月无血缘关系的原发性乳腺癌患者共124例(病例组)，全部经组织病理证实，家族史状况由病史或调查表获得并最后经本人证实。病例组均为单纯早发性乳腺癌患者，无明显家族史，入组患者年龄21～35岁，中位年龄32岁，平均初潮年龄(15±1.5)岁；取101例健康女性为对照组，年龄20～39岁，中位年龄33岁，平均初潮年龄(14±1.6)岁，按年龄与病例组研究对象配对(年龄±4岁)入组。

1.1.2 标本及DNA提取 获得患者知情同意后，抽取外周静脉血5 mL置于含800 μL酸性枸橼酸葡萄糖(ACD)抗凝液的试管中备用。

1.1.3 主要试剂和仪器 FlexiGene DNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)，GeneAmp®9700 PCR系统(美国ABI公司)，HotStar Taq聚合酶(5 U/μL)及试剂盒(美国Qiagen公司)，MassARRAY Analyzer(美国Sequenom公司)。

1.2 方法

1.2.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)法［7-8］此实验与深圳华大基因组研究中心合作完成。⑴DNA提取：从外周血提取基因组DNA，置于-20 ℃冰箱中保存备用。⑵PCR扩增：引物根据oligo-4.0-s软件设计，如表1中所示。PCR的反应体系总体积为5 μL，其中各种引物浓度为0.1 μmol/L，各种dNTP浓度为0.25 μmol/L，MgCl2浓度为1 mmol/L，Taq多聚酶1.25 U，DNA模板2.5 ng。PCR 反应的条件为95 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45个循环；72 ℃延伸3 min，然后4 ℃保存。随后纯化PCR产物进行延伸反应。延伸反应体系总体积9 μL，PCR纯化产物7 μL，延伸混合液2 μL 。反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性5 min，52 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，55个循环；72 ℃延伸3 min，产物于4 ℃保存。每个延伸反应用3 mg Clean Resin树脂纯化后于384孔Spectrometry chip芯片上点样。使用MassARRAY YTM Analyzer进行质谱检测。

1.2.2 基因型的判断 各样本经PCR反应及质谱检测，运行MassARRAY Typer 3.0.1软件进行数据分析，并输出各样本相应位点的基因型。各位点的代表性图谱见图1。

1.3 统计学处理

采用χ2检验进行各基因型和等位基因频率在病例组和对照组间的分布差异比较以及Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验；两组间的流行病学资料均数比较采用t检验；相对危险度采用比值比(odd ratio，OR)和95%可信区间(confidence interval，CI)并应用非条件Logistic回归分析计算，并对混杂因素进行校正。所有统计采用双侧概率检验，以P<0.05为差异有统计学意义；SPSS 17.0用于统计分析。

表1 各基因多态性(SNP)引物信息Tab.1 Primers designed for SNP genotyping

2 结 果

2.1 两组流行病学特征比较

病例组中位年龄小于对照组(P=0.023)，对照组初潮年龄小于病例组的初潮年龄(P=0.00)，说明计算OR时需要予以校正。

2.2 基因型鉴定

PALB2基因rs249954、rs447529及rs16940342的各基因型经MALDI-TOF-MS分析鉴定，结果124例患者和101例健康女性成功进行分型(图1)。

2.3 PALB2基因3个SNP分布

对照组PALB2基因rs249954 CC、CT及TT基因型的频率分别为36(35.6%)、49(48.5%)和16(15.8%)；rs447529 CC，CG及GG基因型的频率分别为3(3.0%)、28(27.7%)和70(69.3%)；rs16940342 AA，GA及GG基因型的频率分别为59(58.4%)、37(36.6%)和5(5.0%)；经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，均符合遗传平衡(P>0.05)，表明其具有群体代表性(表2)。病例组PALB2基因rs249954 CC、CT及TT基因型的频率分别为53(42.7%)、53(42.7%)和18(14.5%)，与对照组相比，差异无统计学意义(P=0.554)；rs447529 CC、CG、GG基因型的频率及rs16940342 AA，GA及GG基因型的频率，两组差异也无统计学意义(P=0.841，P=0.312，表3)。

表2 PALB2 多态性各基因型的HWE平衡Tab.2 Hardy-Weinberg equilibrium calculation for SNP of PALB2 gene

2.4 3种SNP基因型与乳腺癌发病风险的关系

分别以rs249954 CC、rs447529 CC、rs16940342 AA基因型为参照，非条件Logistic回归分析结果提示，各多态性位点未显著性降低患乳腺癌的发病危险(P>0.05，表3)。

3 讨 论

图1 PALB2三个基因多态性基因分型图Fig.1 Representative MALDI-TOF-MS profiles of three polymorphisms genotype of PALB2 gene

表3 PALB2 三个多态性基因型分布及其与乳腺癌发病风险的关系Tab.3 Genotype distribution of three polymorphisms of PALB2 gene and their association with risk of breast cancer[n(%)]

PALB2基因通过和BRCA2基因协同作用而发挥抑癌基因的功能，本研究对PALB2基因的多态性位点rs249954、rs447529、rs16940342与早发性乳腺癌的发病风险关系进行了病例对照研究。结果发现，各遗传多态性位点与乳腺癌的发病风险无明显的相关性。在中国人群进行的散发性乳腺癌研究中，Chen等［5］在江苏人群中发现PALB2基因的rs249954和rs16940342都增加总体人群乳腺癌的发病风险，OR达1.21～1.36；而在上海人群的研究中，Cao等［6］认为PALB2基因 rs447529的含G基因型降低了患乳腺癌的风险，而rs249954和rs16940342基因型则对乳腺癌发病风险无显著影响。我们的研究与上述的研究不同之处在于⑴患者群不同：本研究对象是早发性乳腺癌，与散发性乳腺癌相比，更能代表人群的遗传倾向特征并体现易感基因的影响。⑵人群地域不同：本研究人群来自福建地区，与来自长江下游的江苏、上海人群有所不同，可能代表了不同地域的流行病学特征。⑶研究人群数不同：本研究的例数比散发乳腺癌人群少，可能存在选择性偏移，由于研究对象为具有遗传倾向的乳腺癌，所以该缺陷得到了一定程度的弥补。本研究与Cao等［6］的研究结果相同的是rs249954和rs16940342基因型与乳腺癌的发病无明显相关性，表明不管是散发性乳腺癌还是具有遗传倾向的早发性乳腺癌人群，rs249954和rs16940342的影响是微弱的。

PALB2基因rs249954、rs447529和rs16940342等多态性位点都位于基因序列的内含子区域，并未影响基因的转录过程，其实际的生物学功能和遗传学效应尚不明确；另外其影响是否被潜在的其他未鉴定的位点或潜在易感基因所掩盖，尚需考证。总之，我们认为，PALB2基因多态性在福建汉族人群中有其自身的分布特点，可能与福建地区早发性乳腺癌(≤35岁)的遗传易感性无明显关联，尚不能作为低外显率的乳腺癌易感基因位点。明确PALB2基因遗传多态性位点在中国人群中的确切作用，还需要更大样本的遗传倾向乳腺癌的流行病学研究。

［1］ Song CG, Hu Z, Wu J, et al.The prevalence of BRCA1 and BRCA2 mutations in eastern Chinese women with breast cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol, 2006, 132(10): 617-626.

［2］ Hu Z, Song CG, Lu JS, et al.A multigenic study on breast cancer risk associated with genetic polymorphisms of ER Alpha, COMT and CYP19 gene in BRCA1/BRCA2 negative Shanghai women with early onset breast cancer or affected relatives［J］.J Cancer Res Clin Oncol, 2007, 133(12):969-978.

［3］ Xia B, Sheng Q, Nakanishi K, et al.Control of BRCA2 cellular and clinical functions by a nuclear partner, PALB2［J］.Mol Cell, 2006, 22(6):719-729.

［4］ Rahman N, Seal S, Thompson D, et al.PALB2, which encodes a BRCA2-interacting protein, is a breast cancer susceptibility gene［J］.Nat Genet, 2007, 39(2):165-167.

［5］ Chen P, Liang J, Wang Z, et al.Association of common PALB2 polymorphisms with breast cancer risk: a case control study［J］.Clin Cancer Res, 2008, 14(18): 5931-5937.

［6］ Cao AY, Huang J, Hu Z, et al.The prevalence of PALB2 germline mutations in BRCA1/BRCA2 negative Chinese women with early onset breast cancer or affected relatives［J］.Breast Cancer Res Treat, 2009, 114(3):457-462.

［7］ Milne AN, Carneiro F, O'Morain C, et al.Nature meets nurture: molecular genetics of gastric cancer ［J］.Hum Genet, 2009, 126(5): 615-628.

［8］ Lee DH, Hahm KB.Inflammatory cytokine gene polymorphisms and gastric cancer［J］.J Gastroenterol Hepatol, 2008, 23(10): 1470-1472.