PIM1表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后的关系

田荣华 应韶旭 李晓 黄华

1.上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院血液科，上海 200233；2.南通大学附属海安医院血液科，江苏 南通 226600；3.南通大学附属医院病理科，江苏 南通 226000

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最普通的一种类型，大约占新诊断患者的30%～40%，是一种具有侵袭性、生长迅速并具有临床异质性的中-高度恶性淋巴瘤［1］。患者的预后当前主要依靠5个简单的临床变量组成的国际预后指数（inter-national prognostic index，IPI），但其中没有一个与淋巴瘤生物学相关的变量［2］。到目前为止也没有一个与淋巴瘤生物学相关的预后标志得到公认。cDNA和寡核苷酸微阵列的基因表达经常用来筛选患者的预后因子［3］，但是这个技术费用昂贵且临床应用不方便，因此免疫组化方法经常被用来检测与预后相关基因的蛋白水平。

Pim1基因最早是作为莫洛尼小鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MoMuLV）的前病毒插入点而被发现的，它可以促进小鼠的淋巴瘤的形成［4］。Pim1作为一种原癌基因，在调控细胞凋亡、分化、增殖以及肿瘤形成等方面发挥了非常重要的作用［5］。有研究显示：Pim1基因由于体细胞高频突变而导致其高表达，也有研究表明是染色体异位导致其高表达［6-7］，但其与预后的关系目前仍不能确定。因此，我们的研究目的是通过免疫组化的方法评价PIM1蛋白的表达与DLBCL预后的关系。

1 资料和方法

1.1 资料 收集上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院和南通大学附属医院2002年1月—2006年2月确诊的初发淋巴结起源的DLBCL患者53例进行回顾性分析，其中18例患者来自前者，35例患者来自后者。本实验之前所有患者的病理切片均请2位病理科医生复核过。所有病例都接受了6～8个周期的CHOP方案化疗，15例患者在化疗后淋巴结消退不满意的情况下接受了放疗，但病例均未接受利妥昔单抗治疗，不适合的病例均未入选。53例患者中，男性患者29例，女性患者24例，患者平均年龄55岁（范围12～79岁），平均随访时间32个月（1～86个月）。对53例患者进行了Ann Arbor临床分期，其中Ⅰ/Ⅱ期27例，Ⅲ/Ⅳ期26例。与预后相关的IPI取决于年龄、体能状况、血清乳酸脱氢酶水平（lactate dehydrogenase，LDH）、结外病变的数量、疾病分期这5个临床变量［2］。根据IPI评分分为低危（0～2分）25例和高危（3～5分）28例，患者的具体资料见表1。

1.2 主要试剂 一抗兔抗人PIM1单克隆抗体为Epitomics，为Inc公司产品，一抗兔抗人CD10、BCL6、MUM1单克隆抗体为Dako公司产品，二抗EnVisionTM系统为Dako公司产品。

1.3 实验方法 免疫组织化学EnVision通用型二步法，步骤如下：⑴切片烘片；⑵二甲苯脱蜡；⑶乙醇溶液逐级水化；⑷3%的过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性；⑸抗原微波修复；⑹滴加合适的一抗，置切片于湿盒内，室温静置45 min；⑺滴加EnVision二抗一酶标多聚物，37 ℃放置30 min；⑻滴加0.04%DAB显色液。PIM1、CD10、BCL6和MUM1抗体工作液稀释度为l∶100。以反应性增生的扁桃体作为对照，PIM1抗体着色于扁桃体的上皮和血管内皮及生发中心的幼稚细胞作为阳性对照，而滤泡周围的成熟的小淋巴细胞不着色作为阴性对照（图1）。

表1 PIM的表达及患者的临床特征Tab.1 PIM1 and characteristics of patients with DLBCL

1.4 结果判断 PIM1抗体着色于细胞核视为阳性，免疫组化结果以500个淋巴瘤细胞计数阳性比，阳性病例是指抗体着色≥30%的淋巴瘤细胞。生发中心和非生发中心以CD10、BCL6、MUM1三个抗体区分，具体标准按照Hans等［8］的方法。若切片着色不均，以阳性细胞比例较高区域进行分析，以上结果由上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院病理科和南通大学附属医院病理科医生在双盲情况下观察所得。比较临床参数和PIM1的表达时，我们把这个PIM1的持续性变量转换为二分类变量，≥30%的肿瘤细胞着色定义为高表达，<30%的肿瘤细胞着色定义为低表达［9］。

1.5 疗效评价标准 客观疗效评定标准按我国实体瘤客观近期疗效评定标准［10］。

1.6 随访 所有入选病例临床资料均齐全并可以电话随访，对全部病例以电话形式进行追访，所有患者随访至2009年8月，电话随访的内容包括患者一般状况，以前治疗的情况，近期复查情况。随访期内28例患者死亡，13例患者一直处于缓解中。生存期为病理确诊之日至死亡或最后随访时间。

1.7 统计处理 SPSS 16.0软件进行数据分析处理，分类变量用Fisher’s检验，数值变量用Mann-Whitney检验，生存曲线用Kaplan-Meier分析和比较用Log-rank法，Logistic回归和Cox回归模型分析用于评价pim1和IPI对总生存和化疗缓解率的影响。所有的检验以P<0.05为差异有统计学意义。总生存（overall survival，OS）指从确诊到死亡或上次接触（指没有死亡的病例上次电话随访的时间）之间的时间。

2 结 果

2.1 PIM1在DLBCL中的表达 PIM1着色于细胞核，肿瘤细胞着色比例为0%～100%，平均值为30%。在我们的实验中，所有病例细胞核均着色，在24例（45.2%）PIM1高表达患者中，有5例合并细胞质着色（图1）。PIM1高表达在年龄、性别、LDH水平、分期、B症状之间差异无统计学意义（P>0.05），在其他方面存在差异（P<0.05，表1）。

2.2 PIM1的表达与生发中心表型 根据生发中心的标志，有25例是生发中心起源，其余是非生发中心起源，PIM1的高表达在生发中心起源的淋巴瘤和非生发中心起源的淋巴瘤两组之间存在差异（P=0.005）。

2.3 PIM1的表达与化疗的完全缓解率 所有53例患者全部接受了6～8个周期的CHOP方案化疗，均可评估化疗的反应性。27例（50.9%）患者获得了完全缓解，但其中有14例（51.9%）患者在随访期内复发，其余13例患者在随访期末一直处于完全缓解中。部分缓解和没有缓解的患者分别是19例（35.8%）和7例（13.3%）。PIM1高表达的患者的完全缓解率为29.2%，PIM1低表达的患者的完全缓解率为68.9%（P=0.006）。没有完全缓解的患者比完全缓解的患者具有更高的PIM1的表达（65.4% vs 25.9%），PIM1的表达与复发没有关系。我们对PIM1的表达和IPI分期进行了Logistic回归分析。在单因素回归中显示PIM1高表达的完全缓解率的OR=0.263（95%CI：0.084～0.825，P=0.022），高IPI组OR=0.184（95%CI：0.057～0.559，P=0.005）；在包括PIM1和IPI的多因素回归中，PIM1高表达的完全缓解率的OR=0.374（95%CI：0.110～1.278，P=0.117），高IPI组OR=0.235（95%CI：0.069～0.801，P=0.021）。

2.4 PIM1的表达与患者的总生存 在随访期内28例患者死亡，平均生存时间14个月（1～30个月），3年的总生存率为47.2%。Kaplan-Meier分析显示：PIM1高表达组3年总生存率为29.2%，PIM1低表达组为62.1%；高IPI组3年总生存率为25.0%，低IPI组为72.0%（图2）。PIM1高表达组3年总生存率比PIM1低表达组低（P<0.001），在高IPI组和低IPI组间的差异也有统计学意义（P<0.001）。单因素COX回归分析表明，PIM1高表达组RR=3.755（95%CI：1.684～8.375，P<0.001）；IPI的RR=3.978（95%CI：1.681～9.413，P=0.002）。在包括PIM1和IPI的多因素Cox回归分析表明，PIM1高表达组RR=2.756（95%CI：1.197～6.347，P=0.017）；高IPI组RR=2.947（95%CI：1.203～7.219，P=0.018）。

3 讨 论

在本研究中，我们检测了PIM1在一组原发性结节性DLBCL中的表达，PIM1高表达的患者生存期更短、化疗缓解率较低。虽然PIM1的表达也与其他一些与预后相关的因素有关，如生发中心表型和IPI，但是多因素分析显示，PIM1的表达与IPI不相关。因此，我们的实验结果提示PIM1高表达是DLBCL的一个独立的预后不良标志。

在我们的研究中，PIM1的高表达在单因素回归分析中是化疗完全缓解率的负性预后标志，但在PIM1和IPI多因素分析中并没有意义。我们通过共线性诊断没有发现PIM1和IPI之间存在共线性（VIF=1.121，TOL=0.892），因此我们得出多因素回归中没有意义，可能是与我们的样本量小有关。我们推断PIM1的高表达与化疗的完全缓解率可能相关，但需要更大样本含量的实验证实我们的推断。

据我们所知，本实验是第一次检测PIM1的表达与DLBCL预后的关系。虽然基因表达研究显示：Pim1在某些DLBCL的亚群中与预后相关，但是关于PIM1蛋白与DLBCL的预后的关系尚不清楚。Pasqualucci等［6］研究发现：Pim1是体细胞高频突变的靶点，在50%的非免疫缺陷的DLBCL中可以检测到Pim1基因突变。Akasaka等［7］研究表明：染色体异位导致PIM1的高表达，在一些大B细胞淋巴瘤的发生中可能起着重要的作用。Sivertsen等［11］和Hoefnagel等［12］在基因水平的研究显示：一些亚型的大B细胞淋巴瘤和皮肤起源的DLBCL中，PIM1的高表达可能与患者预后相关，且PIM1的高表达与非生发中心起源的淋巴瘤相关。在我们的实验中，24例PIM1高表达的患者有18例属于非生发中心起源（r=0.404，P=0.003），证实了他们的相关研究结果。我们发现PIM1高表达在单因素和多因素Cox分析均显示是总生存的独立的预后因素。因此，我们的实验结果从PIM1蛋白水平证实了上面这些Pim1基因水平的研究结果。

PIM1蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化许多底物导致相应的生物学功能，主要涉及细胞信号的转导、细胞周期调节、促进生存抑制凋亡，因此在肿瘤发生过程中起着重要的作用［13］。虽然Pim1促进细胞转化的机制没有完全阐明，但一些研究显示它有促进细胞生存的作用［13-14］。最近研究发现的Pim1的底物Bad，是一种促凋亡蛋白，PIM1可以磷酸化Bad的112位的丝氨酸，而该位点是Bad失活的控制点［13］。非磷酸化的Bad可与Bcl-2结合形成异源二聚体，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，而PIM1磷酸化Bad后使其失活，导致细胞生存与凋亡的平衡被打破，因此促进转化细胞的生存［15-17］。根据我们的实验结果PIM1与患者的负性预后相关可能与PIM1磷酸化相应的促凋亡蛋白，导致肿瘤细胞凋亡低下有关。

总之，在DLBCL患者中，PIM1高表达与化疗反应性低和总生存短相关。但我们的实验样本量较小，因此要经过大样本和不同人群的研究来进一步证实我们的发现，PIM1才有可能成为DLBCL的预后标志。

另外，PIM1具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的特性和在肿瘤的形成中具有多样的生物学作用，使得PIM1可以成为一种治疗的靶点［18］。

致谢 衷心感谢上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院病理科张惠箴主任及病理科其他老师和南通大学附属医院病理科老师为我们实验提供的帮助。

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