3种杏香兔耳风提取物抑菌活性的研究

李桂兰 芮 成

江西省医药学校（330200）

杏香兔耳风Ainsliaea fragrans Champ.为我国传统中药，民间以全草入药，具有清热补虚、凉血止血、利湿解毒、发表祛风等作用。已有研究发现，杏香兔耳风中具有良好的抗炎效果，本实验测定了3种杏香兔耳风提取物对常见菌的抑制作用，阐明了其抑菌活性，旨在能开发出一种天然的抑菌药，为杏香兔耳风临床开发利用提供理论基础。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

杏香兔耳风提取物A、杏香兔耳风提取物B和杏香兔耳风提取物C，由本院制剂室提供，置于冰箱中冷藏备用。

1.2 供试菌种

细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、沙门菌（Salmonella sp.）；霉菌：黑曲霉（Aspergillus niger）、桔青霉（Penicillium citrinum）；酵母菌：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由南京师范大学生科院和南京中医药大学微生物实验室提供。

1.3 培养基[1]

牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌的培养），具体组成为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15～20g、水1000mL、pH 7.2～7.4；马铃薯葡萄糖培养基（用于霉菌和酵母菌的培养），具体组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL、pH自然（将马铃薯去皮，切成小块，置于锅中并加水1000mL，煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取其滤液加葡萄糖20g，加琼脂15～20g，并加水补足1000mL，调pH成自然）。

1.4 试剂

乙醇、氢氧化钠、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、苯甲酸钠、山梨酸钾所用试剂均为分析纯，市售的猪肉、茄子、豆腐。

1.5 仪器与设备

HH-2型恒温水浴锅（国华电器有限公司），DRP-9082型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司），KS-120D超声波清洗器（宁波海曙科声超声设备有限公司），D-1型自动蒸气灭菌锅（北京发恩科贸有限公司），DGF30/7-IADC型电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），手动（可调试）移液枪（上海大龙医疗设备有限公司）

2 实验方法

2.1 菌悬液的制备

取试管若干，装入融化的培养基灭菌后摆成斜面。在无菌条件下用划线法将供试菌种移接入相应的斜面培养基上，每个菌种活化多支，放入培养箱中，细菌37℃下培养18～24h，酵母菌和霉菌于28℃下培养48h。然后取出置于4℃冰箱中冷藏。取出活化好的菌种，无菌操作，用适量的灭过菌的生理盐水洗入已灭菌的干净试管中，然后根据实验的需要采用比浊法[2]配置成含菌数为106～107CFU/mL的菌悬液，备用。

2.2 滤纸片扩散法测定杏香兔耳风提取物的抑菌能力

参考姚淑敏[3]的方法并略有改进，将配制好灭过菌的固体培养基溶化后倒入培养皿中，每皿20mL，待冷却、凝固后，用无菌吸管分别加入0.1mL相应的待试菌悬液，用无菌涂布器将菌液涂布均匀，制成含菌平板，置37℃恒温箱中15min后取出，目的使琼脂表面干燥，待用。选择吸水性强的新华一号定性滤纸，用打孔器打成若干直径为6mm的圆形滤纸片，分装于洁净干燥的小培养皿内，50张/皿，干热灭菌后，浸在提取液中，备用。在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置对照组，用无菌镊子镊取浸有提取液的滤纸片贴在含菌平板上，用浸有无菌水的滤纸片作对照。每菌做3次重复，取其平均值。放入培养箱恒温倒置培养，细菌置37℃培养24h，霉菌和酵母菌置28℃下培养48h，取出后测出滤纸片抑菌圈直径大小，比较抑菌效果。

2.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定

参照谢主兰[4]的方法略有改动，将配置的固体培养基在121℃、0.1 MPa条件下灭菌30min，当灭菌培养基冷却至50℃左右时，在无菌条件下准确量取不同体积的提取液加入固体培养基中，配制成浓度5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%的杏香兔耳风提取物系列培养基，每个浓度做3个重复。以不加提取物溶液的培养基为阴性对照。冷却凝固后，每平皿加入0.1mL的菌悬液，涂匀，将细菌置于37℃下培养24h，霉菌和酵母菌置于28℃下培养48h，观察生长情况以不长菌的最低提取物溶液浓度为该提取物的最低抑菌浓度。

2.4 抑菌或杀菌活性的初步探讨[5]

用滤纸片法测定杏香兔耳风提取物对四种细菌的抑菌或杀菌效果，37℃下恒温培养24h后，再分别从平板透明抑菌圈中挑取一小块琼脂进行液体培养18h后，再涂平板，于37℃下恒温培养24h后，观察各平板上菌落的生长情况，有菌落生长即表示提取液对细菌具有抑菌作用，无菌落生长即表示提取液对细菌具有杀菌作用。

3 结 果

3.1 滤纸片扩散法测定杏香兔耳风提取物的抑菌能力

3种杏香兔耳风片提取物的抑菌作用结果见表1。由表1可知3种杏香兔耳风提取物对供试细菌都有一定的抑制作用，其中杏香兔耳风提取物A对大肠杆菌抑菌效果最好，抑菌圈直径达到（12.2±0.27）mm，其次为金黄色葡萄球菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌。杏香兔耳风提取物B对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，抑菌圈直径达到（15.8±0.16）mm，其次为沙门菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。阔瓣含笑对大肠杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到（19.0±0.36）mm，其次为沙门菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。杏香兔耳风提取物C对啤酒酵母有微弱的抑菌效果，抑菌圈直径为（7.2±0.15）mm。杏香兔耳风提取物A和杏香兔耳风提取物B对霉菌和酵母菌以及杏香兔耳风提取物C对霉菌都无明显的抑菌作用。

表1 3种杏香兔耳风提取物的抑菌效果

3.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

杏香兔耳风提取物A、杏香兔耳风提取物B和杏香兔耳风提取物C对供试菌的最低抑菌浓度实验结果见表2～4。表2～4中的数据进一步表明，3种提取物对细菌的抑菌能力明显大于酵母菌和霉菌。从表2可以看出，随着提取物溶液浓度的增加，3种杏香兔耳风提取物抑菌作用相应增强，杏香兔耳风提取物A对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的最低抑菌浓度（MIC）为0.313%，对枯草芽孢杆菌为0.625%；杏香兔耳风提取物A浓度较高时对酵母菌也有一定的抑菌作用，其MIC为10%。从表3可知，杏香兔耳风提取物B对金黄色葡萄球菌的MIC为0.156%，对沙门菌的MIC为0.625%，对大肠杆菌和枯草杆菌的MIC为1.25%。由表4可以看出，杏香兔耳风提取物C对大肠杆菌的MIC为0.156%，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门菌的MIC分别为1.25%、0.625%和0.313%；对酵母菌的MIC为2.5%。可见3种提取物在较低浓度下对细菌都有较明显的抑制作用，在较高浓度时对酵母菌有一定的抑制作用，对霉菌基本无抑制。

3.3 抑菌或杀菌活性的初步探讨

由表5可知，杏香兔耳风提取物A和杏香兔耳风提取物B对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有杀菌作用，而对大肠杆菌和沙门菌可能是抑菌作用；杏香兔耳风提取物C对四种细菌可能都是抑菌作用。

4 讨 论

对一种未知抑菌物质中有效成分抗菌效力的测定，通常是借鉴抗生素微生物检定法，即利用物质抑制或杀死细菌或真菌的程度作为客观指标来衡量物质中有效成分效力的一种方法。根据实验设计原理的不同，检定法一般分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。稀释法包括液体稀释法和固体稀释法，现在已不用来测定抗菌物质的效价，而以之测定抗菌物质的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。该方法程序繁琐，实验结果亦受多种因素影响，即使控制实验条件一致，也会因逐级稀释造成的误差、物质分散的不均匀，导致所得的MIC值可能会有偏差。琼脂平板扩散法是利用抗菌物质在琼脂中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成抑菌圈，根据抑菌圈大小来判断细菌和真菌对抑菌物质的敏感程度，得出抗菌物质的抑菌作用大小和抗菌谱的一种方法。此法简便、易操作，但因抑菌圈大小受多种因素影响，如培养基成分、pH值、琼脂来源和浓度、培养温度和时间、药效、药液浓度等，即使控制条件一致，也会因不同菌种生长到肉眼可见所需时间不同、不同物质扩散系数不同，因而精确度不够高，一般只能用于定性或初步判断其作用强弱。因此本实验采用稀释法和扩散法共同对杏香兔耳风提取物的抑菌效果进行检测，以求达到一个更加准确的结果。

表2 杏香兔耳风提取物A对供试菌的最低抑菌浓度（MIC）

表3 杏香兔耳风提取物B对供试菌的最低抑菌浓度（MIC）

表4 杏香兔耳风提取物C对供试菌的最低抑菌浓度（MIC）

表5 3种杏香兔耳风提取物的抑菌或杀菌的初步探讨

由表1～5可知，3种杏香兔耳风提取物对所选的细菌都有较强的抑菌作用，其中杏香兔耳风提取物A对大肠杆菌抑菌效果最好，杏香兔耳风提取物B对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，杏香兔耳风提取物C对大肠杆菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直径分别为（12.2±0.27）、（15.8±0.16）、（19.0±0.36）mm，最低抑菌浓度分别为 0.313%、0.156%、0.156%。但是3种杏香兔耳风提取物对酵母菌的抑制作用不强，对霉菌基本无抑制作用。杏香兔耳风提取物A和杏香兔耳风提取物B对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌杀菌作用，而对大肠杆菌和沙门菌可能是抑菌作用；杏香兔耳风提取物C对4种细菌可能都是抑菌作用。因此，3种杏香兔耳风提取物具有良好的临床开发应用价值。

[1] 沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M] .北京：高等教育出版社,1999.

[2] 范秀容,李广武.微生物学实验[M] .2版.北京：高等教育出版社,1989.

[3] 姚淑敏.芦荟提取物抑菌作用的研究[J] .食品科学,2002,23(4)：137-139.

[4] 谢主兰,吴文龙.榕树叶抑菌作用的试验研究[J] .食品研究与开发,2004,23(2)：7-9.

[5] 胡静丽.杨梅叶提取物抑菌作用的研究[D] .杭州：浙江大学,2002.