银耳菌种规范化生产工艺讲座 (三)——银耳两个纯菌种的单独分离与混合育成母种的技术

丁湖广

(福建省古田县新元食用菌研究所,古田 352200)

银耳菌种规范化生产工艺讲座 (三)
——银耳两个纯菌种的单独分离与混合育成母种的技术

丁湖广

(福建省古田县新元食用菌研究所,古田 352200)

银耳纯白菌丝;香灰菌丝;分离;育种;交合

1 银耳纯菌丝分离操作技术

单独分离银耳纯菌丝和香灰菌丝,然后进行交合培养的母种,具有适应性好、抗逆力强、朵形美、产量高而稳的优点。可以利用两种菌丝的不同耐旱力,制定银耳纯菌丝分离方法:将新鲜银耳分离材料的基质,通过干燥器逼干,使不耐旱的香灰菌丝先行枯死,进而分离获得耐旱存活的银耳纯菌丝 (图1)。

1.1 菌材选择 在室内外袋栽或瓶栽银耳群体中,挑选长势好、朵形圆正、色白、耳片粗花、肥厚的银耳。认真观察耳基周围是否污染霉菌或放线菌等,袋内颜色是否均匀,若发现污染杂菌或出现杂斑的一律去除。一般以出耳后10～13天健壮期的为好。将挑选好的种耳袋 (瓶)经表面消毒后,把子实体齐耳基切除;挖出耳基正下方及周围较硬的基质块,再将基质块切成半个火柴盒大小的方块,作为分离材料。

1.2 强行逼干 把基质块周围的木屑培养基刮除,将露出白色菌丝体的基质块用卫生纸或纱布包好,置于 “玻璃干燥器”中,干燥器底层置于浓硫酸、五氧化二磷或变色硅胶,以达到脱水逼干效果。10～15天,香灰菌丝即枯死。也可将基质块用纱布包好,挂在通风处,经25天左右自然风干后,即可进行分离。

1.3 定位分离 经过干燥的菌材,从不同部位分离的菌丝,其种质有别:取浅层菌丝分离的菌种,菌丝容易发黄,并在试管内很快展开耳片,菌株生活力较弱,朵型小,易烂耳;若取深层菌丝分离的菌种,其生理成熟度低,也影响成活率。为了得到生活力旺盛,并适合培养料栽培的菌株,必须取中层以下至深层部位的进行分离。该部位分离所得的银耳菌种,成熟度适中,产量稳定。操作时将经脱水后的基质块,置于接种箱内,剥开菌丝,在基质块内层,自上而下或从左至右,用接种针挑取具白色菌丝的木屑小颗粒,移接在琼脂培养基上,一次可接20～30支试管。

图1 银耳纯菌丝的分离过程

1.4 控温培养 接种后的试管,置于22～24℃下,经8～10天的培养,银耳纯白菌丝可以恢复生长。当纯白菌丝出现后,用接种针挑取少许移接到琼脂培养基上培养。若分离培养后还出现香灰菌丝,可继续将分离材料干燥,使香灰菌丝全部死亡后再分离。若培养基偏湿或表面存在水滴,培养后则易出现以酵母状分生孢子方式增殖的现象,或同时出现银耳纯菌丝与酵母状分生孢子。银耳纯菌丝生长十分缓慢,在适温下培养20天左右,其菌落只有豆粒大小。

1.5 提纯扩大 上述第一次分离出来的银耳纯菌丝,待菌落长到黄豆大小时,应进行纯化扩大培养。方法是用接种针在银耳菌落边缘,挑取小米粒大小带培养基的银耳纯菌丝,移接到试管培养基斜面上,每管斜面接2～3个点,然后置于23～25℃下培养10天左右。当接种点周围出现白色短密的菌丝,形似绣球状的白毛团,而培养基不变色,此即为银耳纯菌种。

2 香灰菌丝分离操作技术

获得银耳纯菌丝后,还得分离作为 “开路先锋”的伴生菌香灰菌丝,其来源与分离技术如下。

2.1 从种木中分离 在野生银耳生长的木材中或栽培银耳的段木中,都存在抗逆性及分解基质能力较强的香灰菌丝,经过驯化培养,其性状都十分优良。袋栽银耳的培养基内的香灰菌丝,常因反复移植使用,生命力不如前者旺盛。分离香灰菌丝时,应选取子实体洁白、朵大、开瓣清楚、无病虫害、无烂头和无杂菌的种木,在靠近子实体基部,截取一段作为分离材料。在接种箱内割掉子实体,并熏蒸灭菌,然后从木材断面褐色花纹较密处,切下一小块木材,用0.1%升汞溶液进行表面消毒后,置于培养皿内。再用经火焰灭菌后的解剖刀,削去木材外层,用刀尖将木材切成粗细如同火柴梗,长0.5厘米的小段。取一小段接入琼脂培养基的斜面上,移接后的试管置于24～28℃下,培养5～6天菌丝萌发。随着培养时间的延长,菌丝产生色素溶入培养基中,使之变成黑色。当菌丝长至斜面1/2时,挑取菌落前端的菌丝,转管纯化培养4～5天,便可得到纯香灰菌丝体。

2.2 从木屑培养基中分离 在接种箱无菌条件下,打破 (剪开)银耳菌种瓶 (袋)底部,从大理石状黑色花纹上选取香灰菌丝生长的前端,挑取米粒大小,移接到琼脂培养基斜面上,培养2～3天后斜面上的接种点出现灰白色菌丝,继续培养1～2天,产生绒毛状气生菌丝,并能分泌黑色素使培养基逐渐变为棕黑色。当菌丝长至斜面1/2时,挑取生长旺盛、爬壁力强的香灰菌丝的前端,转管纯化。香灰菌丝生长较快,在24～28℃下培养4～5天,便可获得纯香灰菌丝。

3 两种菌丝的特征与交合育成母种的方法

银耳纯菌丝和香灰菌丝单独分离时,由于分离技术不同,分离效果也不一样。大致可以得到下列几种结果:只得到银耳纯菌丝;只得到羽毛状香灰菌丝;得到银耳纯菌丝和香灰菌丝;得到酵母状分生孢子和香灰菌丝。如果有杂菌干扰,情况就更复杂了。为了得到有生产价值的菌种,在分离的第一周内,必须每天观察一次,判断认定银耳纯菌丝或香灰菌丝各已单独分离出来,然后用于交合母种。

3.1 两种菌丝的辨别

(1)银耳纯菌丝的特征。白色、淡黄色,以及白至黄的各种中间色。气生菌丝直立、斜立或平贴于培养基表层,基内菌丝生于培养基里面。菌丝直径1.5～3微米,有横隔膜,有明显的锁状连合,生长速度比一般食用菌缓慢。在培养基表面会出现扭结的菌丝团,并逐渐胶质化,变成小原基,长成小耳片。当双核菌丝开始胶质化,是菌丝进入结实阶段的标志。双核菌丝移植后,受菌龄、发育程度、培养基表面的游离水和机械刺激等的影响,或继续长菌丝,或迅速胶质化,或变成酵母状分生孢子。

(2)香灰菌丝的特征。初期白色,常有特别细长的主干和侧生的、略呈羽毛状的分枝,老菌逐渐变成浅黄、浅棕色,培养基逐渐由淡褐色变为黑色或墨绿色。培养基表面的气生菌丝呈灰白色、细绒状,有时有碳质的黑疤。分生孢子梗呈扫帚状,较少见,产生时为黄绿色至草绿色,近椭圆形,直径3～5微米,在段木表面还可形成扁平黑色的子座。已知羽毛状香灰菌丝绝不单是1个种,可能有2个属3～4个种。

3.2 两种菌丝交合育成母种的方法 经纯种分离法而得到单一的银耳纯菌丝或香灰菌丝,如果单独接种在棉籽壳或木屑等培养基上培养,是无法形成银耳子实体的。在生产上必须将两者混合培养才能形成高产优质的银耳子实体。因此,人工培育的银耳菌种,必须是银耳纯菌丝与香灰菌丝的混合体。两种菌丝交合培养成母种,一般需要30天左右。具体交合的方法有两种。

(1)在琼脂培养基上交合。用芽孢进行混合培养的,应先接种少许芽孢,待其萌发形成银耳菌丝后,再接种香灰菌丝。如果是用银耳纯菌丝进行混合培养,应将一块带琼脂培养基似米粒大的银耳纯菌丝,移到另1支琼脂斜面上,置22～24℃下培养5～7天。待银耳菌落直径达1厘米以上时,在其旁边接入一小点带琼脂培养基的香灰菌丝,在相同温度下继续培养7天左右,出现绣球状白毛团;10天后在白毛团上方出现无色或淡黄色水珠。香灰菌丝快速生长布满整个培养基,并分泌黑色素,使琼脂培养基底部呈黑色。这种混合菌丝体的银耳母种,1支试管一般只接1瓶原种。

(2)在木屑培养基上交合。先将带琼脂培养基的花生米大小的银耳纯菌丝团接入木屑培养基中央;再用接种针挑取香灰菌丝连同培养基,以小米粒大小移接在菌种瓶的木屑培养基上,两种菌丝块紧靠一起。然后置于22～24℃,空气相对湿度70%以下条件下培养15天左右。待香灰菌丝长至培养基3～4厘米深,瓶壁上可见黑色花纹;白毛团分泌淡黄色或浅褐色水珠时,继续培养5天,白毛团胶质化,出现淡黄色原基,并逐渐长出拇指大小的子实体时,即成木屑培养基母种。

4 银耳 “非专一性”分离择优交合的育种方法

长期以来,我国银耳菌种分离方法强调 “专一性”,即银耳菌丝和香灰菌丝分离时必须在同一耳木或同一袋木屑培养基上,分别获得银耳纯菌丝 (包括酵母状分生孢子)和香灰菌丝进行交合。而不同地区或同一地区,不同耳木或不同木屑培养基获得的两种菌丝,不能随意调换,否则就可能导致失败。

自1993年开始,古田县兴达银耳研究所张汉文所长,开展在不同栽培地点、不同菌株、不同木屑培养基内,分离出银耳菌丝与香灰菌丝,经培养后进行择优调换,互相错开交合的育种试验。结果表明:“非专一性”的择优交合,从母种、原种、栽培种,直至用于袋栽生产,它与“专一性”对照组相比,菌丝生长状况与出耳时间、品质及产量都较优。这说明银耳菌种分离材料,也可以从异地引进野生或段木的香灰菌丝与当地木屑袋栽银耳纯菌丝交合,关键在于选取分离材料时择优母体。优中交合,使菌种不断优化,才能为银耳制种拓宽途径。该所每年都从四川通江等段木栽培地,引进长过银耳的木段,分离香灰菌丝,再与古田袋栽银耳纯菌丝交合,获得理想菌株。以此种 “非专一性”交合育种方法,完成了宁德市科技局 《征集野生银耳种源选育优良菌株研究》项目,选育出抗性强、产量高的2个新菌株,其出耳现场,获得验收组专家好评。

“非专一性”的分离交合,长期被视为难题的原因,主要是当时研究银耳菌种的单位和专业人员不多,发现银耳两种菌丝的历史不长,纯菌丝亲和能力较弱,适应性不强,稍有不周,分离便告失败。所以,这种 “非专一性”的问题一直未被解决。随着银耳人工驯化栽培方式的演变,由段木→木屑瓶内开花→木屑瓶外展片→室内袋料栽培→野外荫棚栽培;由小面积发展到千家万户专业化、商品化、基地化的大规模栽培。这种演变过程,使银耳菌丝的适应性不断增强,“非专一性”交合,在生理上逐步适应,这为 “不同一”择优交合育种提供了内因条件,这是生物进化的自然规律。但从不同野生耳木或不同产地采集分离获得的香灰菌丝,接种在同一培养基上,又会出现不亲和的拮抗线,说明香灰菌品系之间有特殊个性。对此,还有待进一步探讨(图 2)。

图2 不同香灰菌丝接种在同一培养基上产生的拮抗线

5 母种转管扩接方法

一般对分离获得的一代母种,都要进行扩大繁殖,即选择菌丝粗壮、生长旺盛、颜色纯正、无杂菌的试管母种,或从科研部门引进母种,进行转管扩大繁殖,增加母种数量,以满足生产需要。银耳混合菌丝的试管母种,每支一般只能扩接成2～4支。转管次数不应过多,否则菌种长期处于营养生理状态,生命繁衍受到抑制,进而导致菌丝活力下降,营养生长期缩短,子实体变小,变薄,影响产量和品质。因此母种转管扩接,一般宜为3次。

母种转管扩接无菌操作技术如下。

5.1 消毒握管 双手和菌种试管外壁,用75%酒精棉球擦拭;将菌种和斜面培养基的2支试管握在左手中,使中指位于2试管之间,斜面向上,并使其呈水平位置。

5.2 松塞灼口 用右手将棉塞拧转松动,以利接种时拔出;右手拿接种针,对在接种时可能进入试管的部分,全部用火灼烧过;再用右手小拇指、无名指和手掌拔掉棉塞,夹住。靠手腕的动作不断转动试管口,并通过火焰灼烧。

5.3 接种入管 将烧过的接种针伸入试管内,先接触没有长菌丝的培养基,使其冷却;然后将接种针轻轻接触菌种挑取少许,抽出试管,注意菌种块不能碰到管壁;随之将接种针上的菌种,迅速通过酒精灯火焰上方,伸进另一支试管,接入培养基中央。

5.4 回塞管口 菌种接入后,灼烧管口,并在火焰上方将棉塞塞好。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞,以免试管在移动时进入不净空气。

接种的整个过程应迅速、准确。最后将接好的试管贴上标签,送进培养箱 (室)培养。