LC-MS/MS法结合谱库检索测定猪组织中三聚氰胺及其同系物

蔡勤仁,曾振灵,冯家望,彭玉芬,张 毅

(1.珠海出入境检验检疫局,广东珠海 519015;2.华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

LC-MS/MS法结合谱库检索测定猪组织中三聚氰胺及其同系物

蔡勤仁1,曾振灵2,冯家望1,彭玉芬1,张 毅1

(1.珠海出入境检验检疫局,广东珠海 519015;2.华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

采用MRM→IDA→EPI→谱库检索模式建立了猪组织中三聚氰胺及其同系物的液相色谱-电喷雾串联质谱多残留检测方法,结合谱库检索功能同时实现了定性定量分析。组织样品经2%三氯乙酸、10%乙酸铅和乙腈混合溶液提取,Sepucol ENVI-CARB柱净化,三聚氰胺及其同系物的线性范围为10～5 000 μg·kg-1,线性关系良好(r＞0.99);在10～100μg·kg-1添加水平范围内,平均回收率为94.2%～99.9%、相对标准偏差为3.8%～7.5%、方法检出限为2μg·kg-1。

三聚氰胺;猪组织;液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS);谱库

三聚氰胺有多种同系物,如三聚氰酸(cyanuric acid)、三聚氰酸一酰胺(ammelide)、三聚氰酸二酰胺(ammeline)和环丙氨嗪(cyromazine)等,其结构式示于图1。食品和药物管理局(FDA)在引起宠物中毒的食品中检出了以下三聚氰胺同系物:三聚氰胺 8.4%、三聚氰酸5.3%、三聚氰酸一酰胺2.3%、三聚氰酸二酰胺1.7%以及脲基三聚氰胺和甲基三聚氰胺等[1],这些同系物是导致宠物中毒的直接原因。目前,国内外同时检测三聚氰胺及其同系物的方法报道不多,美国FDA和我国国家标准都是采用气质联用法检测奶粉中三聚氰胺及其同系物。Muiz-Valencia等[2]采用液相色谱测定了大米浓缩蛋白中的三聚氰胺及其3种同系物;栾伟[3]研究了宠物食品中三聚氰胺及三聚氰酸的液相色谱串联质谱检测方法;另有鸡蛋、饲料、牛奶等基质中同时检测三聚氰胺及其同系物残留方法的报道[4-8]。美国和我国政府都严禁在饲料或食品中添加三聚氰胺类物质,但三聚氰胺及其同系物在牛奶、鸡蛋、鸡肉、猪肉、鱼等动物源性食品中仍被检出,因此建立一种同时测定这几种结构相似的三嗪类化合物多残留方法非常必要。

本研究选择三聚氰胺及其4种同系物为研究对象,建立相应的液相色谱-串联质谱谱库,结合谱库检索建立猪组织中三聚氰胺及其同系物的LC-MS/MS多残留检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪;API 4000 Q-Trap三重四极质谱仪,配有电喷雾离子源;Agilent固相萃取仪;JOUAN MR23i离心机;Zymark TurboVapLV浓缩站;恒温水浴振荡器等。

Sepucol ENVI-CARB(3 mL/60 mg);三聚氰胺、环丙氨嗪、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸标准品(纯度大于99%):德国Dr.Ehrenstorfer公司产品;三聚氰胺内标 (melamine15N3)和三聚氰酸内标 (cyanuric acid-13C3)(纯度大于 98.0%):加拿大 Toronto research chemicals公司产品。上述标准品用少量二甲基亚砜溶解,甲醇(色谱纯)定容,配制成1 g·L-1标准储备液,再根据需要稀释成适当的标准工作液,于4℃下保存,乙酸铵、乙腈等均为色谱纯;所用试剂除注明外均为分析纯;水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱:Waters Atlantis HILIC(150 mm×2.1 mm×3μm);流动相:5.0 mmol·L-1乙酸铵缓冲溶液(A)和乙腈(B),在0～2 min内溶剂A体积含量为90%,在2～10 min内溶剂A体积含量从90%线性减少到15%,然后保持5 min,在15～17 min内溶剂A体积含量从15%线性增加到 90%,并平衡 8 min;进样量:20 μL。

1.3 质谱条件

离子源:ESI;雾化气65 mL·min-1,气帘气20 mL·min-1,辅助加热气70 L·min-1,辅助加热气温度700℃,碰撞气5 mL·min-1,以上4种气体均为氮气;Q1和Q3均为单位分辨率;ESI模式、去簇电压(declustering potential,DP)、驻留时间(dwell time)和碰撞能(collision energy,CE)等质谱参数列于表1。

1.4 LC-MS/MS谱库

分别用高、中、低3种碰撞能量对5种三聚氰胺类化合物进行 EPI扫描,并用Access编写三聚氰胺及其4种同系物液相色谱-串联质谱数据库。

1.5 样品处理

准确称取2 g(精确到0.01 g)组织样品,分别加入10μL 20 mg·L-1三聚氰胺内标和三聚氰酸内标溶液,12 mL 2%三氯乙酸,2 mL乙酸铅和6 mL乙腈,匀浆30 s,超声5 min,80 ℃加热 20 min,以 5 000 r·min-1离心 5 min,取 10 mL上清液过Sepucol ENVI-CARB 3 mL小柱(小柱分别用3 mL二氯甲烷、甲醇、0.04%乙酸活化),再用3 mL水淋洗,抽干,最后用10 mL甲醇洗脱,收集洗脱液于45℃氮气浓缩至近干,加入1.0 mL 70%乙腈(含0.1%甲酸)溶解残渣,涡旋振荡器振荡1 min,以15 000 r·min-1离心5 min,上清液供液相色谱-串联质谱测定。

1.6 检测模式

MRM→IDA→EPI→谱库检索。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法

5种三聚氰胺类化合物具有不同的p Ka值,因此在溶液中呈现不同的解离状态,要同时实现对5种三聚氰胺类化合物的提取,必须选择合适的溶剂组合。本研究选择三氯乙酸溶液、乙腈、乙酸铅3种提取溶剂进行组合,并研究了超声和加热等前处理方法对提取回收率的影响,最后确定12 mL 2%三氯乙酸、2 mL乙酸铅和6 mL乙腈组合为最佳提取溶剂,当样品经80℃加热20 min时回收率明显提高。通过比较MCX固相萃取柱和石墨碳黑柱的净化效果,结果表明,Sepucol石墨碳黑柱对5种三聚氰胺类化合物的回收率都能满足要求,MCX固相萃取柱对环丙氨嗪、三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的回收率最高,但对三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺几乎无保留。

2.2 色谱条件的选择

环丙氨嗪、三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺为强极性的小分子化合物,在C18键合相色谱柱中几乎无保留。常见的解决方案是添加离子对试剂,形成反相离子对色谱[9]。一般来说,添加高离子强度的缓冲盐和非挥发性的离子对试剂,不适用电喷雾离子源分析。另外,反相离子对色谱难以在一次运行中同时分离酸性和碱性物质。测定三聚氰胺常用磺酸基与C18混合填料色谱柱,这种填料色谱柱利用了阳离子交换与反相保留的机理,增加了碱性化合物与极性化合物的保留,它对三聚氰胺类阳离子化合物有很强的保留,但对三聚氰酸则不能保留。对于极性化合物而言,理想的解决方案是采用亲水色谱(HILIC)。HILIC机理是极性的被分析物在相对非极性的流动相和极性的固定相之间进行分配[10]。正相色谱分离机理通常依靠固定相吸附被分析的物质,而在 HILIC色谱中,水被吸附在固定相的表面,主要依靠分配作用分离,而非吸附作用。在亲水色谱系统中,有机溶剂为弱洗脱溶剂,增加其比例则保留时间变长;水溶液为强洗脱溶剂,增加其比例保留时间会变短。本研究比较了几种 HILIC柱的分离效果,发现Waters Atlantis HILIC柱的分离效果最好。

2.3 质谱条件的优化

用蠕动泵以5μL·min-1的流速连续注射0.5 mg·L-1的5种三聚氰胺类化合物标准溶液,在ESI模式下对以上5种化合物进行一级质谱分析(Q1扫描),得到准分子离子峰[M+1]和[M-1],对于两性化合物三聚氰酸一酰胺与三聚氰酸二酰胺,为获得最好的质谱电离方式,分别于正负离子模式下扫描,结果表明,三聚氰酸二酰胺在正离子模式下[M+H]+响应强度最高,三聚氰酸一酰胺在负离子模式下[M-H]-响应强度最高。然后以分子离子峰为母离子进行子离子扫描。三嗪类化合物的质谱裂解由六元环的开环开始,重组的四元环发生C-N键断裂,产生主要的碎片离子。选取丰度较强、干扰较小的2对子离子为定性和定量离子,以多反应监测(MRM)模式优化每种化合物的去簇电压、碰撞能量等质谱参数。由于同时需要对正负离子进行扫描,因此需要做正负离子切换,如果正负离子切换时间太长,对待测物的灵敏度和峰形都有一定的影响,本研究通过对洗脱梯度的调节,将正负两组离子分开,且两组离子的保留时间有一定间隔。负离子保留时间:三聚氰酸1.19 min,三聚氰酸一酰胺1.38 min;正离子保留时间:环丙氨嗪 5.94 min,三聚氰胺 6.37 min,三聚氰酸二酰胺6.52 min,示于图2。

在0～3 min做 ESI-扫描,在 3～8 min做ESI+扫描,这样就有效的将正负离子切换的损失降到最低。为了同时实现定量定性的要求,本研究采用 MRM→IDA→EPI→谱库检索的模式,利用 Q-Trap的线性离子阱功能,在 MRM获得化合物的保留时间、峰高、峰面积、离子比率等信息的同时,通过 EPI扫描获得1张二级质谱图,可用已经建立好的谱库进行检索,这对化合物的结构确认有很大帮助,实际样品检测示谱图于图3～5。

图2 三聚氰胺及其同系物标准物质的提取离子图(50μg·kg-1)Fig.2 Extracted product ion spectrum of melamine and its homologues(50μg·kg-1)

图3 三聚氰胺阳性样品重构离子色谱图Fig.3 Reconstituted ion chromatogram of the doubtful positive sample

图4 阳性可疑样品EPI扫描图Fig.4 EPI mass sepctrum of the doubtful positive sample

图5 阳性可疑样品谱库检索Fig.5 Results of search library for the doubtful positive sample

2.4 线性范围、变异系数、回收率和检测限

将三聚氰胺类药物混合标准储备液用空白组织提取液依次稀释成10～5 000μg·L-1系列浓度,并加入 10μL三聚氰酸-13C3和三聚氰胺-15N3内标溶液,按1.5方法测定。将测得的各种三聚氰胺类药物峰面积的平均值(X)与所对应的药物浓度(Y)做线性回归,内标法定量,其中三聚氰胺、环丙氨嗪、三聚氰酸二酰胺用三聚氰胺-15N3校正,三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺用三聚氰酸-13C3校正,求得标准曲线回归方程和相关系数(r)。准确取2 g(准确至0.01 g)组织样品 ,分别制得 10、50、100μg·kg-1添加水平样品,并加入三聚氰酸-13C3和三聚氰胺-15N3内标溶液,内标浓度均为100μg·kg-1,按照上述方法处理和测定。每个浓度做5个重复,共做4批,并计算回收率和变异系数。本方法三聚氰胺及其同系物的检出限,线性范围,回归方程,回收率及相关系数列于表2。

3 结 论

建立了测定猪组织中三聚氰胺及其4种同系物的高效液相-电喷雾质谱多残留检测方法,该方法采用MRM→IDA→EPI→谱库检索模式,能同时实现定量定性分析。方法在10～5 000μg·L-1浓度范围内,线性关系良好,相关系数均大于0.99,在10～100μg·kg-1添加水平范围内的平均回收率为94.2%～99.9%,相对标准偏差为3.8%～7.5%,方法检出限为2μg·kg-1。该方法的技术指标满足国内外对三聚氰胺及其4种同系物检测的相关要求。

表2 方法的检出限、线性范围及相关系数Table 2 The limits of detection,linearity,recovery and precision of the method

[1] FDA.Interim melamine and analogues safety/risk assessment[EB/OL].http://www.Fda.gov/OHRMS/DOCKETS/98fr/07n-0208-ra00001.pdf.

[2] MUNIZ-VAL ENCIA R,CEBALLOSMA-MAGANA S G,ROSAL ES-MARTINEZ D,et al.Method development and validation for melamine and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography[J].Application to Animal Feed Samples,2008,392(3):523-531.

[3] 栾 伟.宠物食品中三聚氰胺及三聚氰酸的液相色谱串联质谱法分析[J].分析测试学报,2008,27:203-206.

[4] SANCHO J V,IBANEZ M,GRIMAL T S,et al.Residue determination of cyromazine and its metabolite melamine in chard samples Residue determination of cyromazine and its metabolite melamine in chard samples by ion-pair liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2005,530(2):237-243.

[5] EHLING S,TEFERA S,HO I P.High performance liquid chromatographic method for the simultaneous detection ofthe adulteration ofcereal flours with melamine and related triazine by-products ammeline,ammelide,and cyanuric acid[J].Food Addit Contam,2007,24(12):1 319-1 325.

[6] 祝伟霞,袁 萍,杨冀州,等.亲水色谱-串联质谱法对牛奶与奶粉中三聚氰胺及其衍生物含量的测定[J].分析测试学,2008,27(11):2 881-2 921.

[7] 王 冉,刘铁铮,柳伟荣.SPE-HPLC法测定鸡蛋中灭蝇胺-环丙氨嗪[J].浙江农业学报,2005,(6):376-379.

[8] 冯家望,蔡勤仁,柳训才,等.高效液相色谱-电喷雾串联技术测定奶及奶制品中三聚氰胺和环丙氨嗪[J].现代食品科技,2008,24(10):1 058-1 060.

[9] 于世林.高效液相色谱方法及应用[M].北京:化学工业出版社,2000:98.

[10] Hemstromk I P.Hydrophilic interaction chromatography[J].J Sep Sci,2006,29(12):1 784-1 821.

Determination of Melamine and Its Homologues in Pig Tissues by LC-MS/MS Combining with Spectral Library Search

CAI Qin-ren1,ZENG Zhen-ling2,FENGJia-wang1,PENG Yu-fen1,ZHANG Yi1
(1.Zhuhai Entry&Exit Inspection and Quarantine B ureau,Zhuhai519015,China;2.College of Veterinary Medicine,South China A gricultural University,Guangzhou510642,China)

MRM→IDA→EPI→spectral library search model was used to establish a HPLC-electrospray ionization tandem mass spectrometry method for the multi-residue detection of melamine and its homologues in pig tissues.The quantitative and qualitative analysis of the target analytes were achieved by with spectral library search function.Tissue samples were treated with 2%trichloroacetic acid,10%lead acetate solution and acetonitrile for extraction,purified with Sepucol ENVI-CARB column.The analytical method in the present study was well validated,and good results were obtained with respect to precision,repeatability and spiked recovery.The limit of detection is 2μg·kg-1for melamine and its homologues,and with a linear range from 10 to 5 000μg·kg-1.The recoveries are between 94.2%and 99.9%,and RSDs are between 3.8%and 7.5%.

melamine;pig tissues;LC-MS/MS;spectral library

O 657.63

A

1004-2997(2010)05-277-06

2009-12-21;

2010-05-11

蔡勤仁(1974～),男,博士,高级工程师,从事食品安全研究。E-mail:mr.cai@vip.163.com