阿魏酸钠对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的防治作用

谌洪俊，苏 宁 ，陈昱江 ，朱春玲，李 龙

（1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002； 2.贵阳医学院附属医院，贵州 贵阳 550004）

肾间质纤维化是各种肾脏疾病进入终末期的共同病理损害，采取各种措施阻止肾间质纤维化的发生是临床防治肾小管间质病变、保护肾功能的重要目标之一。肝细胞生长因子（HGF）能促进小管上皮细胞增殖，同时具有抗凋亡的作用，能够拮抗小管间质纤维化[1]。因此，笔者选用HGF研究新型内皮素受体拮抗剂阿魏酸钠（SF）防治单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾间质纤维化的作用环节和机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 试剂与动物

试剂：一抗分别为兔抗大鼠HGF，小鼠抗大鼠!－平滑肌肌动蛋白（!－SMA）单克隆抗体(中山生物公司)，生物素标记山羊抗兔IgG，生物素标记山羊抗小鼠IgG，链酶亲和素－过氧化物酶复合物，封闭用正常山羊血清；二氨基联苯胺（DAB）显色系统（博士德生物公司），链霉素亲和素－生物素－辣根过氧化物酶(SABC)试剂盒。

动物及分组：雌性SD大鼠（贵阳医学院动物中心，清洁级），体重180～200 g，适应性饲养 1周后，随机分为 4组，即假手术组（SHAM组），模型组（UUO组），洛汀新治疗组[血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）组]，SF治疗组，每组均为12只。

1.2 模型建立与给药方法

UUO组及两治疗组均予戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射以麻醉大鼠。取左侧背部脊柱旁1 cm、肋下1 cm纵形切口，逐层分离，找到并游离输尿管，结扎并剪断输尿管，逐层缝合，清洁伤口，得UUO动物模型。SHAM组仅行输尿管游离而不结扎，其余处理方法相同。SF组和ACEI组于手术前1 d分别按110 mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d)灌胃给药[2－3]；SHAM组及UUO组以等量清水灌胃。试验期间大鼠自由进食进水。第9天断头处死大鼠，取术侧肾组织，置10%甲醛溶液中，用于病理切片和免疫组化染色。

1.3 检测指标及半定量分析方法

肾小管间质病理改变：将10%甲醛溶液固定的肾组织常规石蜡包埋切片，经HE及Masson染色后，显微镜200倍放大后分别在左上、左下、右上、右下、中间各取2个视野，每张切片共10个视野，依据间质纤维化、小管萎缩、间质浸润、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、小管扩张、小管细胞空泡变性8项指标来观察肾间质病理改变并作肾小管间质损伤指数评分[4]。

免疫组织化学方法：采用SABC法。载玻片应用APES防脱片处理。石蜡切片常规脱蜡，新鲜配制3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，复合消化液37℃消化1 h。正常山羊血清封闭液室温封闭20 min。分别滴加不同的一抗，37℃孵育1 h。滴加生物素化羊抗小鼠或抗兔 IgG，37℃孵育 30 min。滴加 SABC复合物，室温下孵育30 min。最后加入DAB显色液，显微镜下控制显色时间，苏木素衬染，脱水、透明、封片。试验同时采用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）替代一抗的方法作为阴性对照。将染色切片于高倍镜下(200×)观察15个不重复的肾小管间质视野，测定阳性染色面积占1个视野面积的百分比做半定量分析，观察肾脏!－SMA及HGF的表达。

1.4 统计学方法

使用SPSS 11.10 for Windows软件，数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。HGF与各项指标之间做Pearson相关分析。

2 结果

2.1 SF对肾脏病理的影响

肉眼观察可见，SHAM组肾脏大小、形态正常，颜色暗红；UUO组结扎侧肾脏肿大，颜色变浅，有囊性感，切开后可见褐色混浊尿液，肾实质变薄。光镜下，SHAM组偶见肾小管上皮细胞空泡变性，灶状单核细胞浸润；UUO组可见弥漫的肾小管上皮细胞空泡变性，多数肾小管扩张、萎缩，偶见坏死，肾间质有多灶状单核细胞浸润和纤维化，肾小球无明显病变。SF组及ACEI组上述改变均有所减轻，且肾小管间质损伤指数明显下降(P＜0.05)，但仍高于SHAM组的水平。

2.2 SF对肾组织内HGF和α-SMA表达及分布的影响

HGF表达：SHAM组小管间质内几乎无表达。UUO组阳性表达主要在肾小管周围细胞，尤以髓质区明显，少量肾小管上皮细胞胞浆也为阳性表达（图1）。

图1 免疫组化示HGF的表达(200×)

!－SMA表达：SHAM组的血管壁平滑肌细胞呈强阳性，肾小球和肾小管上皮细胞无明显着色，肾髓质稀疏散在分布呈弱阳性。UUO组表达部位以肾间质为主，主要围绕在萎缩或扩张的肾小管周围，或可见散在于纤维化的肾间质中（图2）。

图2 免疫组化示!－SMA的表达(200×)

半定量分析比较：结果见表1。UUO组的!－SMA及HGF表达均较SHAM组明显上调(P＜0.01)，SF组和ACEI组!－SMA的表达均较UUO组明显减少(P＜0.01)，且两组间比较无统计学差异（P＞0.05）。SF组及 ACEI组 HGF 的表达高于 UUO 组（P＜0.05），但两组间比较无统计学差异（P＞0.05）。HGF与肾小管间质损伤指数 (r=0.917,P ＜0.01)及 ! －SMA(r=0.841，P ＜0.01)均为正相关关系。

表1 各组大鼠肾小管间质损伤指数、!－SMA及HGF的改变

3 讨论

正常肾组织!－SMA的表达仅见于肾脏血管，而肾小球和肾间质中无或极少表达,说明正常肾脏几乎无肌成纤维细胞（MyoF）。在各种病因（如炎症、免疫反应等）刺激下，表达!－SMA的MyoF可在肾小球系膜区、肾小球周围间质、萎缩的小管周围纤维化区域及血管周围增生，参与肾脏纤维化形成[5]。本试验的结果也显示，!－SMA的表达与肾间质纤维化程度呈密切的正相关关系，提示预后不良。本试验中还观察到!－SMA主要表达于肾间质细胞及部分小管上皮细胞，由此推测病理条件下成纤维细胞的分化、肾小管上皮细胞的转分化均可能参与了肾间质中MyoF的形成，这与文献报道基本一致[6]。

生理条件下，肾脏HGF仅表达于间质来源的细胞上，包括肾小球系膜细胞、间质成纤维细胞等，其生物学作用主要是保持正常肾脏结构和功能，促进肾小管上皮细胞的有丝分裂、形态发生，并抑制其凋亡[7－8]。有试验研究证实，急性肾损伤后，组织及血浆中的HGF浓度反应性升高，对于维持和重建肾小管结构和功能的完整性起着重要作用[9]。体外试验也证明，HGF具有促进肾小管细胞再生、有序化排列形成小管分支和细胞移动的作用[10]。对UUO小鼠小管间质纤维化的研究证实，单独HGF基因治疗7 d及14 d后，其抑制!－SMA表达率分别为54%和60%，并能抑制纤维连接蛋白（FN）及"型胶原等间质的沉积，抑制转化生长因子－#（TGF－#）及其受体的表达[11]。进一步的研究表明，HGF与TGF－#在肾间质纤维化进程中存在互逆效应，在近曲小管细胞培养液中，HGF能完全阻止由TGF－#所诱导的上皮细胞向MyoF转化[12]。本试验中，UUO组术后9 d梗阻侧肾HGF表达均明显高于SHAM组，且治疗组较模型组表达增高，并与!－SMA相互间呈正相关表达，提示在慢性肾脏疾病的早中阶段，HGF在肾脏反应性表达增高可发挥其重要的保护及修复功能，且洛汀新及SF能通过上调HGF的表达发挥抗间质纤维化作用。

内皮素1（ET－1）不仅为强烈的缩血管肽，而且是一种强炎症介质。肾组织多种细胞（如肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和成纤维细胞等）均能合成及分泌成熟的ET－1，同时表达其受体，通过自分泌和旁分泌作用发挥多种病理生理学效应[13]。研究表明，ET－1能够刺激体外培养的人肾间质成纤维细胞增殖并上调其TGF－#的表达，而选择性内皮素受体拮抗剂能够特异地阻断上述效应[14－15]。田雪飞等[16]证实ET－1可能参与 UUO大鼠的肾间质纤维化过程，而内皮素受体拮抗剂波生坦有可能通过抑制TGF－#而拮抗纤维化。SF是中药阿魏、川芎等的有效成分，是一类新的非肽类内皮素受体拮抗剂。有研究证实，SF能减轻糖尿病肾病大鼠TGF－!的表达及ECM的沉积[2]。本试验观察到SF能明显下调UUO组大鼠"－SMA的表达，发挥抗纤维化效应，推测SF可能通过阻断ET－1与其受体的结合，进而抑制TGF－!表达，促进HGF的表达，从而改善肾脏的纤维化病变。另外，SF的抗炎作用也可能参与了抗纤维化的进程，但具体机理有待于进一步深入的实验及临床研究。

综上所述，内皮素系统可能参与了肾间质纤维化过程；SF对于UUO模型同样具有使肾小管扩张及萎缩减少、肾间质内单核细胞的浸润减少、间质纤维化病变减轻的治疗作用，且疗效与ACEI类药物相似，并与贝那普利一样能上调肾脏保护性因子HGF，发挥重要的修复和再生作用，有着良好的临床应用前景。

[1]Yang J,Dai C,Liu Y.Systemic administration of naked plasmid encoding hepatocyte growth factor ameliorates chronic renal fibrosis in mice[J].Gene Therapy(Basingstoke),2001,8(19):1 470 － 1 479.

[2]赵同峰，张 梁，邓华聪.阿魏酸钠对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制研究[J].中国中西医结合杂志，2004，24(5)：445 －449.

[3]陈运芬，朱春玲，李 龙.单核细胞趋化蛋白－1和#型胶原在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达[J].贵州医药，2004，28（1）：10 － 12.

[4]Radford MG,Donadio JV,Bergstral EJ,et al.Predicting renal outcome in IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,1997,8(2):199 － 207.

[5]Pedagogos E,Hewitson TD,Walker RG,et al.Myofibroblasts involvement in chronic transplant rejection[J].Transplantation,1997,64(8):1 192 －1 197.

[6]Crupp C,Troche I,Klass C,et al.A novel model to study renal myofibroblasts formation in vitro[J].Kidney Int,2001,59(2):543 － 553.

[7]Yamashita Y,Jeschke MG,Wolf SE.Differential expression of hepatocyte groeth factor in liver,kidney,lung,and spleen following burn in rats[J].Cytokine,2000,12(9):1 293－1 298.

[8]Ueda T,Takeyama Y，Hori Y,et al.Hepatocyte growth factor increases in injured organs and functions as an organotrophic factor in rats with experimental acute pancreatitis[J].Pancreas,2000,20(1):84 － 93.

[9]祝高红，朱忠华，张 春，等.肝细胞生长因子在大鼠肾间质纤维化中作用机制的研究[J].医学研究生学报，2004，17（4）：319 － 321.

[10]Liu Y,Rajur K,Tolbert E，et al.Endogenous hepatocyte growth factor ameliorates chronic renal jijury by activating matrix degradation pathways[J].Kidney Int,2000,58(5)：2 028 －2 043.

[11]Yang J,Dai C,Liu Y.Hepatocyte growth factor gene therapy and angiotensin$blockade synergistically attenuate renal interstitial fibrosis in mice[J].J Am Soc Nephrol,2002,13（10）：2 464 － 2 477.

[12]Yang J,Liu Y.Dissection of key events in tubular epithelial to myofibroblast transition and its implications in renal interstitial fibrosis[J].Am J Pathol,2001,159(4)：1 465 － 1 475.

[13]Kohan DE.Endothelins in the normal and diseased kidney[J].Am J Kidney Dis,1997,29(1):2－26.

[14]王海燕.肾脏病学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1996:477－478.

[15]田雪飞，唐功耀，谌贻璞.内皮素1及内皮素受体A拮抗剂对人肾间质成纤维细胞的作用[J].中华医学杂志，2002，82(1):5－9.

[16]田雪飞，唐功耀，谌贻璞.内皮素受体拮抗剂对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的保护作用[J].中华医学杂志，2003，83（6）:510 －514.