北京市污水厂污泥中的内分泌干扰效应物质

陈月华，高洁，*，马梅，饶凯锋，李文忠，何春利，刘操

1.西南大学农学与生物科技学院，重庆400715

2.中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室，北京100085

3.北京市水利科学研究所，北京100085

北京市污水厂污泥中的内分泌干扰效应物质

陈月华1，高洁1，*，马梅2，饶凯锋2，李文忠3，何春利3，刘操3

1.西南大学农学与生物科技学院，重庆400715

2.中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室，北京100085

3.北京市水利科学研究所，北京100085

采用重组基因酵母法检测了北京市16个污水处理厂污泥的雌激素、雄激素和孕激素效应.结果表明，各污水厂污泥中均可检测到雌激素受体诱导效应，范围在0.587～6.76ngEEQ·g-1（dw）之间.各水厂污泥均未检测出雄激素诱导效应和孕激素诱导效应，大部分污水厂污泥样品表现出较明显的雄激素抑制效应和较强的孕激素抑制效应.与国外相比，北京市污水厂污泥中的雌激素活性值相对较低.堆肥处理不能有效去除雌激素类物质和孕激素抑制物质，但对雄激素抑制物质的去除明显.

内分泌干扰物；生物测试；污水厂污泥

Received 8 January 2010 accepted 15 February 2010

Abstract：This study tested for estrogenic effect,androgenic effect and progestogenic effect of sewage sludge from sixteen sewage treatment plants in Beijing using a recombinant yeast bioassay.Estrogenic activity can be detected for all the sewage sludge,with rang from 0.587 to 6.76ngEEQ·g-1（dw）of estradiol equivalent.None of samples showed androgenic activity and progestogenic activity.However,major part of samples showed obviously inhibitory effect for androgen,and strong inhibitory effect for progestogen.In general,the estrogenic activity in the sludge in Beijing was lower than those reported elsewhere.The composting process could not remove efficiently estrogen-like chemicals or progestogenic inhibitors, but could remove efficiently androgenic inhibitor from sewage sludge.

Keywords：endocrine disruptive chemicals；bioassay；sewage sludge

1 引言（Introduction）

污水厂污泥的环境污染问题一直以来都是人们关注和研究的热点.近年来随着内分泌干扰物在水体中的广泛分布，以及人们对污水处理过程中内分泌干拢物去除机制的认识（杜兵等，2004），随污泥排放进入环境的内分泌干扰物问题引起了人们的高度重视.早期的一些研究已经证实污泥具有内分泌干扰效应.Waring等（1996）将污水处理厂污泥暴露于虾虎鱼、虎刺鱼，结果发现50%的雌性虾虎鱼产卵受到明显的抑制.Paul等（2005）发现在施用污泥的牧场上，公绵羊幼崽睾丸发育下降，内分泌系统也呈现失调状态，而且影响持续至其成年期.伴随着污泥的环境内分泌问题的相继报道及污泥安全回用的呼声日益高涨，对污泥进行内分泌干扰效应检测和评价已成为一种紧迫的任务.

国内外对污泥的内分泌干扰效应研究目前相对较少，仅有的研究也局限于有限的内分泌干扰物分析.如莫测辉等（2001）和蔡全英等（2001）对我国不同城市污泥的有机污染物种类和含量进行了分析，并研究了邻苯二甲酸酯在污泥中的分布和含量；Cheng等（2000）分析了台湾城市污泥中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、壬基酚（4-NP）的含量，进一步研究了不同环境条件下好氧消化污泥中DEHP的降解情况.然而污泥是一个复杂的混合体系，由各种酚类、多环芳烃、多氯联苯、二噁恶英及邻苯二甲酸盐等有毒有害物质组成，化学分析很难对污泥中为数众多的污染物进行逐一定量.生物测试方法简便、快速、灵敏，能综合评价环境样品的内分泌干扰效应，目前已广泛应用于环境水样的内分泌干扰检测（饶凯锋等，2005;李剑等，2006;崔青等，2007）.

本研究采用重组人雌激素受体基因酵母、重组人雄激素受体基因酵母和重组孕激素受体基因酵母检测了北京市16个污水处理厂共17个污泥样品的雌激素效应、雄激素效应和孕激素效应，以期对北京市主要污水厂污泥的内分泌干扰物排放水平有一个大致的估算.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 样品前处理

污泥样品于2009年10月采集自北京市16个污水处理厂，以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P表示.除D厂采集了生污泥和堆肥后消化污泥外，其它污水处理厂采集的均是生污泥.

采集的污泥经冷冻干燥（FD21冷冻干燥机，北京博医康技术公司）后，研磨成粉末，过40目筛，避光保存.准确称取1g污泥，用100mL丙酮：二氯甲烷（体积比为1：1）的混合液在索氏提取器中先浸泡过夜，再抽提24h.提取液用旋转蒸发仪（瑞士Buchi）浓缩至1～2mL后，转移至K-D浓缩器中，氮吹，最后加入500μL二甲基亚砜（DMSO）溶解.每个样品均稀释至6个浓度梯度，-20℃保存以待生物测试.

2.2 酵母菌的冻存与复苏

重组孕激素受体基因酵母由Gaido教授赠送，采用添加有硫酸酮、腺嘌呤、赖氨酸、色氨酸的SC培养基.重组雌激素受体基因酵母和重组雄激素受体基因酵母为本实验室自主构建，为稳定转染有人雌激素基因片断hER或人雄激素基因片断hAR和共激活因子GRIP1的双杂交酵母，主要采用缺乏亮氨酸和色氨酸的SD培养基.

将1mL新鲜冻融的酵母菌液加入到30mL培养液中，30℃、150rpm培养过夜.取过夜培养的菌液稀释10倍于600nm处测定吸光度值，要求菌液的OD600为0.6～0.8.向培养基中加入体积分数为15%的无菌甘油，以1mL分装于EP管中，按4℃→-20℃→-80℃逐步降温，最后保存在-80℃冰箱中（庄丽丽等，2010）.

2.3 重组基因酵母测试

重组基因酵母测试方法参考以前的文献（李剑等，2008;Ma et al.,2005;Li et al.,2008）.将过夜培养的菌液进行稀释，加入培养基调节其吸光度至0.75左右.将995μL的酵母菌液与5μL的样品涡旋混匀.取200μL的混合液加入到96孔板中，每个浓度设至少3个平行测试.同时每板设定阳性对照（2×10-10mol·L-1的17β-雌二醇或5×10-8mol·L-1的二氢睾酮或10-9mol·L-1的孕酮，分别对应于重组雌激素、重组雄激素和重组孕激素酵母）和阴性对照（DMSO）.为保证实验数据的可靠性，所有样品均做重复实验.将96孔板置于微孔摇床（Heidolph TITRAMAX 1000,Hamburg,Germany）上，30℃、800rpm暴露培养 2h.以上均为无菌操作.测定 OD595的值（酶标仪 Tecan,GENios,Austria）.将培养板中的菌液吸出 150μL，加入120μL分析缓冲液（每100mL的基础缓冲液中加入3.33mL浓度为0.1%的SDS溶液和270μL β-巯基乙醇.基础缓冲液的配制：将 21.51g的Na2HPO4·12H2O、6.22g的 NaH2PO4·2H2O、0.75g的KCl和0.25g的MgSO4·7H2O溶解并定容于1L的蒸馏水中），30℃、800rpm继续培养10min后加入20μL氯仿，于摇床上1300rpm振荡10min破碎酵母细胞.加入40μL O-NPG（13.3mmol·L-1，溶解于基础缓冲液中）启动酶反应，计时直至出现明显的黄色.反应完成后加入100μL碳酸钠（1mol·L-1）终止.吸取200μL转移到酶标板中，测定OD420值.

检测样品的抗激素效应则需将990μL的菌液与5μL样品及5μL标准诱导剂（5×10-8mol·L-1的二氢睾酮或10-9mol·L-1的孕酮）共暴露培养，其它步骤与上述一致.

2.4 数据分析

β-半乳糖苷酶活性u值的计算：

式中：u为β-半乳糖苷酶活性（U）；t为酶反应时间（min）；V为反应体积（mL）；D为稀释因子；OD′420为阴性对照在420nm处的吸光度值；OD420和OD595为样品在420nm和595nm处的吸光度值.

样品的雄激素效应和孕激素效应均以诱导率和抑制率表征，公式如下：

式中：u（s）为样品诱导酵母产生的酶活性值；u（p）为阳性对照（二氢睾酮、孕酮）诱导酵母产生的酶活性值（庄丽丽等，2010）.

样品的雌激素效应用17β-雌二醇标定：将样品的酶活与实验中测定的17β-雌二醇的剂量-酶活关系曲线对比后得到雌二醇当量值（EEQ）（李剑等，2008）.

雄激素诱导率和抑制率及孕激素诱导率和抑制率均以0.5mg污泥所诱导或抑制的β-半乳糖苷酶活性计算.

3 结果与分析（Results and analysis）

3.1 重组基因酵母体外测试

利用重组雌激素受体、雄激素受体和孕激素受体的酵母分别检测了17β-雌二醇、二氢睾酮、孕酮的效应，通过函数拟合方程计算出EC50值（表1），与文献报道的该3种物质在重组基因酵母中的结果类似（Rehmann et al.,1999;Sohoni and Sumpter, 1998;Death et al.,2004）.

表1 重组基因酵母检测已知诱导剂的半数浓度Table 1 EC50values of the known agonists in the recombinant yeast bioassay

3.2 污泥样品的重组基因酵母检测

图1 17个污泥样品的雌激素受体诱导效应（1～4：污水处理厂A～D的生污泥样品；6～17：污水处理厂E～P的生污泥样品；5：D厂污泥的堆肥产物）Fig.1 The inductive effect of the seventeen sewage sludge on estrogen receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D;6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P;5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

17个污泥样品的雌激素受体诱导效应如图1所示.污泥样品的雌激素受体诱导活性用17β-雌二醇的当量值EEQ表示.由图1可见，17个污泥样品雌激素受体诱导活性范围在 0.587～6.76ngEEQ·g-1（dw）之间，其中以M厂的污泥EEQ值最高，C厂、E厂和O厂的污泥EEQ值相对较低，前者数值约为后者的10倍.采集于不同污水处理厂的污泥其雌激素活性显示出一定的差距，可能与处理水源、处理水量、处理工艺及污泥类型等有关.D厂污泥雌激素活性为 2.04ngEEQ·g-1（dw），经堆肥消化处理后雌激素活性不但没有消失，反而有所升高，增至3.58ngEEQ·g-1（dw）.分析其原因，可能与微生物作用有关.因为从人类或动物体内排出的雌激素是以非活化的共轭结合态形式存在（主要是葡糖酸苷和硫酸盐形式），而伴随着动物排泄而进入环境中的大肠杆菌能合成β-葡糖酸苷酶（Dray et al.,1972），通过降解葡糖酸苷解开共轭键使雌激素重新活化，雌激素效应得以增加.研究发现污水处理过程能够释放结合态的雌激素（Desbrow et al.,1998;Tyler and Routledge, 1998;Allen et al.,1999;Ternes et al.,1999）.经过堆肥处理后，结合态的雌激素被进一步释放，所以消化后的污泥雌激素活性有一定的提高.据此，可以考虑在污泥样品的前处理过程中加入活化的步骤，使结合态的雌激素得以全面释放，以获得更准确的数值.另外，Ternes等（2002）在研究污泥的内分泌效应过程中也发现，雌激素类物质可以伴随着整个污泥消化过程.

Motoyama等（2006）用酵母双杂交法检测了21种由污泥和牲畜粪便制成的混合肥料的雌激素效应，发现13种具有明显的雌激素活性.基于人雌激素受体的双杂交酵母检测值为14～168pmol·L-1（EEQ），比本研究的结果要高一些.原因可能是混和肥料里除了污泥外，还添加有牲畜粪便，而牲畜粪便是环境激素的一个重要来源.为了促进牲畜的生长，饲料里添加了许多促生长剂包括雌激素类物质，这些物质随牲畜的排泄物进入周围环境.文献报道的德国两个污水处理厂的活性污泥中雌激素的含量分别为5ng·g-1和17ng·g-1（Ternes et al.,2002），也高出本研究的结果.

一些环境污染物既能模拟内源激素与受体结合诱导基因表达，也能与内源激素竞争核受体抑制基因表达，即同时表现出诱导效应与抑制效应.鉴于此，本实验同时检测了样品的雄激素诱导效应和抑制效应及孕激素的诱导效应和抑制效应.表2结果显示，除D厂污泥堆肥、G厂污泥和O厂污泥未检出雄激素诱导活性外，其余水厂污泥均显示一定程度的雄激素活性；反之，除A厂、E厂、H厂、I厂和M厂的污泥检测出孕激素诱导活性外，其余水厂污泥均未检出此效应.各样品雄激素诱导率和孕激素诱导率均在10%以下（表2），因此17个样品均不显示显著的雄激素诱导效应和孕激素诱导效应（Hamers et al.,2006）.在Motoyama等（2006）的研究中也发现，21种由污泥制成的混合肥料中仅2种表现出雄激素活性，总活性值范围在5～75pmol·L-1（以二氢睾酮当量值AEq表示）之间，雄激素活性值与本实验结果相似.家畜排放的激素中，孕激素的量远大于雄激素，雌激素则相对较少（Lange et al.,2002）.然而孕激素在污水中更易降解（Labadie and Budzinski,2005）；另据报道经活性污泥处理48h后，也有超过50%的孕激素被降解（Norpoth et al.,1973），这可能是污泥的孕激素诱导活性值较低的原因.

表2 北京城市污泥的雄激素诱导效应和孕激素诱导效应Table 2 The androgenic activity and progestogenic activity of municipal sludge in Beijing

抑制实验结果表明，雄激素受体抑制效应除C厂污泥未检出外，其余样品均有检出（图2）；孕激素受体抑制效应除A厂污泥未检出外，其余样品均显示较强的效应（图3）.D厂污泥经堆肥处理后，雄激素抑制率在10%以下，抑制效果已不明显，说明堆肥消化处理在雄激素抑制物质的去除中起到了关键的作用（图2）.但堆肥消化处理对孕激素抑制物质的去除并不显著（图3）：孕激素抑制率仅由消化前的66.62%降低到消化后的57.48%，因而认为堆肥处理不能有效去除孕激素抑制物质.

内分泌干扰物对动植物及人类具有一定的毒害，有关这方面的研究报道已有不少.王晓娟等（2003）发现添加有酞酸酯类化合物邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的拟南芥茎段愈伤组织诱导率低；显微切片结果显示DBP会干扰拟南芥试管的形态发生.Norrgren等（1993）、Engwall等（1994）、袁秀平等（1999）和张凤君等（2001）都在研究中发现当环境激素进入鱼体时，鱼体的代谢会受到影响尤其是肝脏受到损伤；对于性腺的影响主要表现为雌化、两性、畸形等.除此之外，内分泌干扰物能引起人的神经系统的功能障碍，对免疫系统和生殖系统的影响也较大.污泥农用如今已成为世界各国主要的污泥处置方式.若将本研究中的污泥不经过处理直接农用，污泥中的内分泌干扰物会通过植物的根系吸收与污泥中的营养元素一起进入植物体内，影响植物的生长发育.因为大多数内分泌干扰物具有亲脂性或不易降解性，所以通过生物富集和食物链的逐级放大作用最后可能造成体内蓄积，进而影响人类健康及生态系统的平衡.污泥的堆肥处理是一种较普遍的资源化利用方式.但本研究发现污泥经堆肥处理后其所含的内分泌干扰物并不能够完全去除：孕激素抑制物质仍然存在，雌激素类物质反而有所增加.因而进一步推测，污泥堆肥化制成的复合肥在一定程度上存在着潜在的危害性.

图2 17个污泥样品的雄激素受体抑制效应（1～4：污水处理厂A～D的生污泥样品；6～17：污水处理厂E～P的生污泥样品；5：D厂污泥的堆肥产物）Fig.2 The inhibitory effect of the seventeen sewage sludge on androgen receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D; 6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P; 5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

图3 17个污泥样品的孕激素受体抑制效应（1～4：污水处理厂A～D的生污泥样品；6～17：污水处理厂E～P的生污泥样品；5：D厂污泥的堆肥产物）Fig.3 The inhibitory effect of the seventeen sewage sludge on progesterone receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D; 6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P; 5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

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The Endocrine Disrupters of Municipal Sewage Sludge in Beijing

CHEN Yue-hua1，GAO Jie1，*，MA Mei2，RAO Kai-feng2，LI Wen-zhong3，HE Chun-li3，LIU Cao3
1.College of Agronomy and Biotechnology,Southwest University,Chongqing 400715
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
3.Beijing Hydraulic Research Institute,Beijing 100085

1673-5897（2010）2-215-07

X882.5，X131.3

A

高洁（1959—），女，博士，西南大学农学与生物科技学院教授，硕士生导师，主要从事生态学、植物生理学、生物化学等的研究.

2010-01-08 录用日期：2010-02-15

国家高技术研究发展计划（863） 探索导向项目（No.2007AA06Z414）；国家高技术研究发展计划（863） 项目（No. 2007AA06A407）；北京市科技计划项目（No.KY-2009-03）

陈月华（1983—），女，硕士研究生，E-mail:waic2009@sina.com；*通讯作者（Corresponding author），E-mail: gaojiexn@sohu.com