点柄乳牛肝菌中麦角甾醇的分离鉴定及含量测定

杨帅，李开通，张艺轩，曹阳，石钺

（中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所,北京100193）

点柄乳牛肝菌中麦角甾醇的分离鉴定及含量测定

杨帅，李开通，张艺轩，曹阳，石钺*

（中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所,北京100193）

研究点柄乳牛肝菌的化学成分，发现其主要指标性成分，建立其含量测定方法。将点柄乳牛肝菌用溶剂提取，硅胶柱分离，通过波谱技术对化学结构进行鉴定。采用HPLC法，色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相为纯甲醇；检测波长为284 nm。结果表明，麦角甾醇为点柄乳牛肝菌的指标性成分，麦角甾醇在0.64 μg~12.80 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9992，麦角甾醇的平均回收率均为98.19%，RSD为2.04%。

点柄乳牛肝菌；麦角甾醇；分离；高效液相色谱法

Abstract：An index compound,ergosterol,in the extract of Suillus granulatus was isolated by column chromatography and its structure was elucidated by spectroscopic analysis.An HPLC method was established for the determination of ergosterol in the extract of Suillus granulatus.The determination was carried out with Kromasil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）,using pure methanol as mobile phase and detected at the wavelength of 284 nm.The results showed that a good linear relationship in the range of 0.64 μg-12.80 μg（r=0.9992）was obtained for ergosterol.The average recovery was 98.19%,RSD was 2.04%.The method is simple,accurate,and with a good reproducibility which can be used to control the quality of the extract of Suillus granulatus.

Key words:Suillus granulatus;Ergosterol;isolation;HPLC

点柄乳牛肝菌（Suillus granulatus(Fr.)Kuntze）属牛肝菌目乳牛肝菌科真菌，民间食用已久，广泛分布于云南、河北、贵州、吉林等省区。在西欧各国被推崇为著名的营养食品，是菌类中换汇率较高的畅销商品。牛肝菌营养丰富，味道鲜美，是深受欢迎的著名食用菌，具有清热解烦、养血和中、助消化、追风散寒、补虚提神之功效；民间常用于治疗感冒咳嗽，食积腹胀，脾虚神疲及妇女白带过多等症；也有驱风解毒、消肿功效的记载[1]。曾有文献报道，该菌子实体CH2Cl2提取物对革兰阳性菌和革兰阴性菌有显著的抑制活性，对肿瘤细胞也有一定的抑制活性[2-3]；在试验中发现，该菌子实体乙醇提取物具有良好的通便作用。为了弄清该真菌的生物活性成分，同时对该菌乙醇提取物建立稳定可行的质量控制方法，对其子实体进行了化学成分研究，发现麦角甾醇可作为指标性成分，用于控制点柄乳牛肝菌及其提取物的质量。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Fisher-Johns显微熔点测定仪（未校正）；Varian-300型核磁共振仪；Agilent1100-API3200液相色谱-质谱联用仪（正离子模式）；Waters 600型高效液相色谱仪（Waters 600系统，Waters 2487检测器，Millennium32色谱工作站）；METTLER AB135-S型十万分之一电子天平；KQ-250DB型数控超声波清洗器。

薄层层析和柱层析用硅胶均为青岛海洋化工厂产品；含量测定用甲醇为色谱纯，其它化学试剂均为分析纯。真菌样品采自于云南，由首都师范大学微生物教研室范黎博士鉴定为牛肝菌目乳牛肝菌科点柄乳牛肝菌（Suillus granulatus(Fr.)Kuntze），样品存放于本实验室。

2 方法

2.1 提取分离

点柄乳牛肝菌冷冻干燥品202 g，用95%乙醇加热回流两次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，浓缩液湿法拌样，硅胶柱层析（160目~200目），经石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，分别得到6部分洗脱物，其中第2部分中有大量白色结晶析出，经薄层展开显示为同一化合物，合并，得单体M10。

2.2 结构鉴定

对分离得到的化合物进行MS分析、1H-NMR和13C-NMR图谱分析鉴定，确定化合物的结构。

2.3 测定色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相：纯甲醇；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：284 nm。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取麦角甾醇对照品6.40 mg，置10 mL棕色量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL中含麦角甾醇0.64 mg。

2.5 供试品溶液制备

精密称取点柄乳牛肝菌乙醇提取物0.1041 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入无水乙醇10 mL，称定重量，超声处理20 min使溶解，冷却至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，过滤，滤液作为供试品溶液。

3 结果与讨论

3.1 化合物结构鉴定

单体M10为白色针晶（乙醇），mp 148℃。MS、1HNMR和13C-NMR波谱数据如下：

上述数据与文献[4-5]基本一致，故该化合物被鉴定为麦角甾-5，7，22-三烯-3β-醇（麦角甾醇）。

3.2 含量测定系统适用性考察

在测定色谱条件下，供试品中麦角甾醇与其它组分分离度良好（见图1），利于含量测定，其柱效（n）及分离度（R）计算如下：

上述两式中：tR为保留时间（以分钟或长度计，但应取相同单位）；Wh/2为半高峰宽；tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2为此相邻两峰的缝宽。

根据计算结果，确定含量测定时的理论板数按麦角甾醇峰计不得低于3000。

3.3 线性关系考察

分别精密量取对照品溶液 1、5、10、15、20 μL 注入液相色谱仪中，测定，以麦角甾醇进样量为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。计算麦角甾醇的回归方程为：Y=988788X－192569，r=0.9992，表明麦角甾醇在0.64 μg~12.80 μg范围内线性关系良好。

图1 点柄乳牛肝菌乙醇提取物中麦角甾醇HPLC测定图谱Fig.1 The chromatogram of extract from Suillus granulatus

3.4 精密度试验考察

精密吸取对照品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定，重复5次，每次进样10 μL，测得麦角甾醇峰面积积分值的相对标准偏差为1.22%，表明仪器精密度较高。

3.5 稳定性试验考察

精密量取供试品溶液，在 0、2、4、6、8、12 h 各进样10 μL，测得麦角甾醇峰面积积分值的相对标准偏差为1.97%，说明样品在12 h内稳定。

3.6 重复性试验考察

精密称取同一批供试品5份（批号：20070412），每份约0.1 g，同上处理，按2.3项下色谱条件测定5次，每次进样10 μL，测得麦角甾醇含量的相对标准偏差为1.38%，表明方法重复性较好。

3.7 回收率试验考察

采用加样回收法，取已知含量的供试品6份（批号：20070412），每份约 0.05 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.64 mg/mL的麦角甾醇对照品溶液2.0 mL，置50 mL具塞三角瓶中，按2.5项方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定，每次进样10 μL，计算回收率，结果麦角甾醇的平均回收率为98.19%，RSD为2.04%，说明本法回收率良好，方法可行。

3.8 样品测定

取4批点柄乳牛肝菌乙醇提取物，每批称取约0.1 g，精密称定，按2.5项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定，每批样品测定3次，每次进样10 μL，按线性方程计算麦角甾醇含量，结果见表1。

表1 点柄乳牛肝菌乙醇提取物中麦角甾醇含量测定结果Table 1 The Contents of Ergosterol in the extracts from Suillus granulatus

4 结论

麦角甾醇是真菌类的特征甾醇，具有增强人体抗病和预防感冒之功效，经常食用可预防、治疗血钙代谢障碍而导致的伛偻病，还可防止机体各种黏膜炎及皮肤炎。它是脂溶性VD的前体，经紫外线光化学反应生成VD，VD在调节生命代谢功能上有重要作用。本实验从柄乳牛肝菌中分离得到麦角甾醇，并对化学结构进行了鉴定。采用高效液相色谱法，建立了点柄乳牛肝菌主要指标性成分麦角甾醇的含量测定方法，方法学考察，麦角甾醇在0.64 μg~12.80 μg范围内呈良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性、回收率等试验符合相关要求，且操作简便快速，可以作为点柄乳牛肝菌及其提取物的质量控制方法。

[1]袁明生,孙佩琼.四川覃菌[M].成都：四川科学技术出版社，1995：239-311

[2]Tringali C,Geraci C,Nicolosi G,et al.An antitumor principle from suillus granulatus[J].J Nat Prod,1989,52:844-845

[3]董泽军，王飞，王睿睿，等.点柄乳牛肝菌子实体中抗HIV-1活性成分[J].中草药，2007，38(3)：337-339

[4]万辉，孙荣奇，吴达俊，等.栗色圆孔牛肝菌中的三种甾醇成分[J].天然产物研究与开发，1999，11(6)：18-21

[5]李厚金，林永成.麦角甾醇及其衍生物的氢化学位移溶剂效应[J].分析测试学报，2004，23(3)：26-30

Isolation and Determination of Ergosterol from Suillus Granulatus

YANG Shuai,LI Kai-tong,ZHANG Yi-xuan,CAO Yang,SHI Yue*
（Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193,China）

2009-09-03

杨帅（1983—），女（汉），硕士研究生，研究方向：中药药效成分分析。

*通信作者：石钺（1963—），男（汉），研究员，研究方向：中药药效物质基础研究及质量控制。