液相色谱法快速测定乳制品中三聚氰胺含量

郭立泉，辛若竹，丁梅，闫吉昌

（1.吉林工商学院生物工程分院，吉林长春130062；2.梅河口市产品质量检验所，吉林梅河口135000；3.东北师范大学化学学院，吉林长春130024）

液相色谱法快速测定乳制品中三聚氰胺含量

郭立泉1，辛若竹2，丁梅2，闫吉昌3，*

（1.吉林工商学院生物工程分院，吉林长春130062；2.梅河口市产品质量检验所，吉林梅河口135000；3.东北师范大学化学学院，吉林长春130024）

建立高效液相色谱法快速测定乳制品中三聚氰胺的分析方法。采用三氯乙酸溶液-乙腈提取乳制品中的三聚氰胺，用强阳离子交换色谱柱（SCX，250 mm×4.6 mm，5 μm），在流动相配比为0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH＝3.0）-乙腈（65+35，体积比）条件下分离，紫外检测器210mm波长检测。结果表明：采用外标法定量，该方法在0.10mg/L～10.0 mg/L浓度范围内有良好的线性关系，加标回收率均在91%以上，相关系数R2为0.9999，相对标准偏差不大于1.2%，方法最低检出限为0.01 mg/L。通过实验室间能力验证证明，该方法具有快速、准确、灵敏度高，样品前处理简便易行等优点，可满足实验室日常快速检测乳制品中三聚氰胺的工作需求。

液相色谱法；强阳离子色谱柱；紫外检测器；乳制品；三聚氰胺

Abstract:An analysis method for quick determination of melamine from dairy products by HPLC has beendeveloped.Trichloroacetic acid-acetonitrile was used to extract melamine from dairy products,and HPLC analyses were performed using the following operating parameters：strong cation exchange column（SCX,250 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase ratio：0.05 mol/L KH2PO4（pH=3.0）/acetonitrile （65+35,volume ratio）,UV detector wavelength 210 nm.This method with good linearity relation between 0.10 mg/L-10.0 mg/L adopted external standard method.The recovery was above 91%and the coefficient of correlation R2was 0.9999.The relative standard deviation（RSD）was less than 1.2%.The limit of detection was 0.01 mg/L.This method is quick,precise and sensitive,it also has good advantage of simple pretreatment,which satisfies the needs of routine testing melamine of dairy products.

Key words：liquid chromatography；strong cation exchange column；UV detector；dairy products；melamine

国家卫生部已将三聚氰胺列为非食用物质禁止添加到乳制品及含乳食品中，新颁布的乳品安全国家标准更以食品安全风险监测和评估数据为依据，突出安全性要求，突出与人体健康密切相关的限量规定，进一步明确了对三聚氰胺“零容忍”的规定，因此三聚氰胺的检测已成为日常判定乳品是否安全的必检项目之一。目前三聚氰胺在食品中残留量的分析方法有很多报道，但多采用液相色谱法（HPLC）C18或C8色谱柱分离[1-5]，需要使用固相萃取小柱净化样品，操作步骤繁琐，分析时间长，且回收率偏低；一些采用强阳离子色谱柱快速分离的方法[6-7]，也只适用于相对基质干扰小的原料乳的测定，所以日常工作中很需要建立奶粉等乳制品中三聚氰胺的快速测定方法。本文参照GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》、GB/T 22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速检测》检测方法，对色谱条件及样品处理进行了探讨和研究，采用强阳离子色谱柱（SCX），以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相进行分离，可在线有效去除奶粉等乳制品中杂质干扰，提高检测效率，获得满意的结果。并通过实验室间能力验证证明，该方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点，可满足实验室日常快速检测乳制品中三聚氰胺的工作需求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

LC20AT岛津高效液相色谱仪（配SPD20A UV-检测器、LCsolution工作站）；强阳离子交换色谱柱（CNWSIL SCX，250 mm×4.6 mm，5 μm）；WP-UP-UV-05超纯水机：四川沃特尔科技发展有限公司；H1650高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；QB-600高速振荡混合器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ-500DE超声波清洗器：江苏昆山市超声仪器有限公司；AL204-1电子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；PHS-2C酸度计：上海雷磁仪器；FB-20T溶剂过滤器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.1.2 试剂

色谱纯乙腈（Fisher Scientific）；三聚氰胺标准品（纯度99.5%，Chemserwice）；优级纯磷酸二氢钾、优级纯磷酸、分析纯三氯乙酸：国药集团化学试剂有效公司；一次性注射器（2 mL）；水相/有机相滤膜（0.45 μm）；25 mL具塞刻度试管。

1.2 色谱条件

强阳离子交换色谱柱（SCX，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：磷酸二氢钾缓冲液（0.05 moL/L，pH=3.0）∶乙腈=65∶35（体积比）；检测波长 210 nm；流速1.5 mL/min；柱温 30℃；进样量 20 μL。

1.3 标准溶液及磷酸缓冲液的配制

1.3.1 储备液

准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品，用水完全溶解后，100 mL容量瓶中定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4℃冰箱中冷藏保存，有效期1个月。

1.3.2 标准溶液

精确吸取三聚氰胺标准储备溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，此溶液每毫升相当于10 μg三聚氰胺。于4℃冰箱中冷藏保存。

1.3.3 标准工作溶液

准确吸取标准溶液 （10 μg/mL）0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于 8个 10 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，配成 0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的标准溶液系列。

1.3.4 0.05 moL/L磷酸盐缓冲液

称取6.8 g磷酸二氢钾（准确至0.01 g），加水800 mL完全溶解后，用磷酸调节pH值至3.0，用水稀释至1 L，用滤膜过滤后备用。

1.4 样品处理

称取奶粉等乳制品2.5 g（精确至0.01 g）于25 mL具塞刻度试管中，加入1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈5 mL，超声提取10 min，再于振荡混合器上振荡提取10 min后，用水定容至刻度，混匀。以10000 r/min高速离心15 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤，滤液过有机滤膜后，供HPLC测定。

1.5 校准曲线的绘制与样品测定

取1.3.3配制的三聚氰胺标准溶液系列经0.45 μm水系膜过滤后，按从低到高浓度顺序分别进样20 μL，以标准工作溶液浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标，绘制校准曲线。同时取制备好的待测样液样20 μL分别进样，获得目标峰面积。根据校准曲线计算被测试样中三聚氰胺的含量。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

三氯乙酸溶液和乙腈都可沉淀蛋白质提取三聚氰胺。由于奶粉等乳制品中成分复杂，按文献[6-7]直接用乙腈提取，沉淀蛋白质的效果不理想，杂质干扰严重且容易出现坏柱等问题，见图1。

本文选择用三氯乙酸溶液-乙腈混合液作为乳制品中的蛋白质的沉淀剂和三聚氰胺提取剂。试验发现，随着取样量的不同，即随着样品中蛋白质和杂质含量的增多，适当增加三氯乙酸溶液-乙腈混合液的使用量，能完全沉淀蛋白质和杂质，离心后获得较好的上清液。经多次试验证明，取样2.5 g，加入1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈5 mL，经超声、振荡各提取10 min后，以10000 r/min高速离心，能有效地去除基质干扰，且回收率较高。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

三聚氰胺是强极性化合物，在普通C18或C8柱上保留值很低，接近死时间流出，不能进行分析，必须使用离子对试剂，同时还需要使用固相萃取小柱净化样品，不仅操作繁琐，分析时间长，造成回收率偏低，而且去除干扰峰的效果并不理想见图2。

本文采用强阳离子交换色谱柱，可在线去除杂质干扰，净化样品，免去使用固相萃取小柱要经上样、洗脱、氮吹等繁琐步骤，不仅可有效节约时间，提高检测效率，而且节约检测成本。

2.2.2 检测波长的确定

将配制好的三聚氰胺标准液（2 μg/mL）在190 nm～300 nm波长处进行紫外扫描，发现三聚氰胺在210 nm和240 nm处均有特征吸收，但以210 nm处响应值高，是240 nm处响应值的4.3倍，且杂质峰少，基线稳定，因此选择210 nm作为检测波长，可有效地降低方法的检出限，提高检测灵敏度。

2.2.3 流动相的优化

参照文献[6-7]选取磷酸盐（pH=3.0）-乙腈缓冲液作为流动相。由于样品基质中紧靠三聚氰胺出峰位之后总有个干扰峰出现，而且这2个峰的出峰时间很近，很难完全分离。如果流动相中磷酸盐和乙腈的比例选择不当，很容易使目标峰与干扰峰重合或峰分离效果不好，造成假阳性或检测数据不准确而误判。本试验研究比较了流动相中磷酸盐缓冲液的不同体积分数对目标峰与干扰峰分离效果的影响，结果见表1。

表1 磷酸盐体积分数对分离效果的影响Table 1 Effect of phosphate volume fraction on separation efficiency

由表1可知：磷酸盐缓冲液体积分数为65%时，目标峰与干扰峰分离效果最好，且峰型对称，出峰时间比较理想。

2.2.4 标准溶液、空白样品及样品加标色谱图

在本文优化的色谱条件下，得到了三聚氰胺标准液、奶粉空白样品和奶粉加标样品的色谱图（见图3～图 5）。

从三聚氰胺标准液色谱图（图3）可知三聚氰胺出峰时间为11.554 min；从空白样品色谱图（图4）和加标样品色谱图（图5）可以确定，三聚氰胺峰和基质干扰峰得到很好的分离，可满足检测工作需要。

2.3 线性范围、线性方程与检出限

在选定的色谱条件下，按“1.5”项绘制三聚氰胺校准曲线（各种浓度取3次进样平均值），得回归方程为y=3.18×10-6x+8.57×10-3和相关系数 R2=0.9999。表明：三聚氰胺在 0.1 μg/mL～10 μg/mL 的范围内，其浓度和峰面积有良好的线性关系。另外将低浓度的三聚氰胺标准溶液不断稀释，进样。当S/N=3时，方法最低检出限为0.01 mg/L；当S/N=10时，方法定量检出限为0.04 mg/L，说明该方法具有很高的检测灵敏度，是国标GB/T 22400-2008检测法灵敏度的5倍。

2.4 方法的精密度和回收率

在未添加三聚氰胺的空白液态奶和奶粉中分别添加1.0、3.0、5.0 mg/kg 3个水平的标准溶液进行试验，每个添加水平进行5次平行测定，按本方法进行提取净化和测定，计算平均加标回收率均在91%以上，相对标准偏差不大于1.2%，具体数据见表2，说明该方法准确、稳定、可靠。

表2 精密度及回收率测定结果(n=5)Table 2 Results of precision and recovery(n=5)

2.5 样品测定及结果评价

市场上随机选取奶粉、纯牛奶、奶饮料3种样品；能力验证考核试样为A、B、C 3种奶粉样品，共6种样品。分别用本文方法对其三聚氰胺含量进行测定见表3。

表3 样品检测结果及评价Table 3 Determination results and evaluation

评价结果表明：本文方法测定的结果均以|Z|值＜1的理想值接近于真值，说明该方法的准确度极高。

3 结论

该方法具有快速、准确、灵敏度高，样品前处理简便易行等优点。不仅可有效节约时间，提高检测效率，而且可降低检测成本，易于推广普及。适于奶粉等乳制品中三聚氰胺的批量、快速的检测分析。

[1]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法[S].北京：中国标准出版社,2008：2-4

[2]中国人民共和国农业部.NY/T1372-2007饲料中三聚氰胺的测定[S].北京：中国标准出版社,2007：1-3

[3]汪辉,彭新凯,李文丽,等.高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究[J].食品科学,2008,29(10)：531-535

[4]徐晓枫,蒲云霞,包玉龙,等.高效液相色谱法测定乳清粉中的三聚氰胺[J].中国卫生检验杂志,2009,19(3)：541-542

[5]侯冬岩,刘晓媛,刁全平,等.酸奶饮料中三聚氰胺的高效液相色谱法分析[J].鞍山师范学院学报,2008,10(6)：27-29

[6]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法[S].北京：中国标准出版社,2008：1-4

[7]肖洋,栗周伟,冯永渝,等.原料乳中三聚氰胺的高效液相色谱法测定[J].畜牧与饲料科学,2009,30(1)：45-46

Studies on Quick Determination of Melamine of Dairy Products by HPLC

GUO Li-quan1,XIN Ruo-zhu2,DING Mei2,YAN Ji-chang3,*
（1.Department of Bioengineering，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062,Jilin,China；2.Meihekou Quality Supervision and Inspection Station of Product，Meihekou 135000,Jilin,China；3.Department of Chemistry of Northeast Normal University，Changchun 130024,Jilin,China）

2010-06-29

郭立泉（1971—），女（汉），副教授，博士，主要从事生物工程研究。

*通信作者：闫吉昌（1943—），男，博士生导师。