利用响应面法优化虾青素发酵培养基

侯娟，王际辉，叶淑红，王晗

（大连工业大学生物与食品学院，辽宁大连116034）

利用响应面法优化虾青素发酵培养基

侯娟，王际辉*，叶淑红，王晗

（大连工业大学生物与食品学院，辽宁大连116034）

以红法夫酵母为研究对象，对其生物合成虾青素的培养基组分进行研究。首先进行单因素试验，确定最适培养基组分。再利用Plackett-Burman设计法考察培养基组分对虾青素生物合成的影响，选出2个对虾青素生物合成最为重要的营养因素：葡萄糖和复合氮源（牛肉膏∶柠檬酸三铵=1∶2，质量比）。最后通过响应面法确定红法夫酵母产虾青素最佳培养基组分，分别为葡萄糖3.65%，复合氮源0.45%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉0.1%，CaCl20.01%。此时虾青素含量可达到11.81 mg/L，比优化前提高了近190%。

红法夫酵母；虾青素；培养基；响应面法

Abstract:The paper focused on the fermentation medium components of astaxanthin produced by Phafia rhodozyma.At first,the fermentation components of the strain were studied through single factor tests.Then the effect of the medium compositions on astaxanthin biosynthesis was investigated according to the Plackett-Burman design.The two important factors,glucose and complex nitrogen source（beef extract:ammonium citrate acid=1 ∶2，mass ratio） for astaxanthin biosynthesis were selected from all factors.At last response surface methodology was applied to optimize medium components：glucose3.65%,complex nitrogen source 0.45%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%，yeast extract 0.1%，CaCl20.01%.Then the yield of astaxanthin reached 11.81 mg/L，which increased 190%compared with that of the non-optimized condition.

Key words:Phaffia rhodozyma;astaxanthin;fermentation medium;response surface methodology

虾青素是一种具有优良的色素沉积作用、能促进动物发育、具有超强抗氧化活性及较强抗肿瘤活性的类胡萝卜素[1-3]。红法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作为虾青素生物来源的一些必要特征：虾青素是主要的类胡萝卜素，大约占到40%~95%，能够利用多种糖作为碳源进行异养代谢；培养时间短；不需要光照；能够在发酵罐中实现高密度培养[4]。因而红法夫酵母被认为是一种最具研究价值的虾青素大规模生产的来源。虽然利用红法夫酵母生产虾青素获得了一系列的成果，但是与其他新兴发酵产品相比，酵母发酵生产虾青素具有产量低、生产成本高等问题，大规模商业化生产不普遍。因此，还应在培养基的优化，降低生产成本和提高产量等方面作深入研究。

通过培养基优化，来提高虾青素的含量和原料的利用率，以得到适合产业化生产的高产菌株都具有重要的理论意义和应用价值[5]。以此为出发点，利用响应面法[6]，优化红法夫酵母发酵生产虾青素的培养基。

1 材料和方法

1.1 菌种

红法夫酵母：大连工业大学食品生物技术实验室保藏。

1.2 主要培养基

种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，麦芽汁0.3%。

发酵培养基：葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.1%，CaCl20.01%。

1.3 培养条件

种子摇瓶：250 mL的三角瓶装液25 mL，从斜面上取两环菌种在22°C，150 r/min,培养48 h。

发酵培养：250mL三角瓶装液30mL，接种量10%，22 °C，150 r/min，培养 72 h。

1.4 测定方法

1.4.1 虾青素的提取

二甲亚砜(DMSO)法[6]：取10 mL发酵液,离心后用去离子水洗涤离心3次，加3.5 mL 55℃的DMSO破壁，最后用15 mL丙酮提取。离心(8000 r/min，5 min)取上清液。如果提取不完全，再次破壁后加丙酮提取，直至菌体呈白色为止。并测出对应的菌体生物量。

1.4.2 虾青素含量的测定

分光光度法[7]：在480 nm下测丙酮提取液OD值。

式中：虾青素总量，mg/L；A为吸光度；Va为提取液的体积，mL；E为丙酮的消光系数（0.16）；Vb为发酵液的体积，mL。

2 结果与分析

2.1 碳源种类对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响

在无碳源发酵培养基中，分别添加20 g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙醇和可溶性淀粉，于22℃，150 r/min下发酵72 h，然后测定生物量和虾青素产量，结果见图1。

微生物利用碳源物质具有选择性。从图1可知，葡萄糖和蔗糖利于生物量和虾青素的积累，蔗糖的生物量高于葡萄糖，但虾青素的积累却低于葡萄糖。以乙醇和淀粉为碳源时，虾青素的胞内比例较高，但是由于生物量较低，造成虾青素的产量较低。而以乳糖为碳源时，生物量和虾青素产量均较低，菌体几乎没有生长。可能是由于红法夫酵母体内缺乏乳糖分解利用的酶。从虾青素产量角度，选用葡萄糖作为发酵的碳源。

2.2 氮源种类对红法夫酵母生长和虾青素合成的影响

在无氮源发酵培养基中，分别添加5 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸铵和柠檬酸三铵，于22℃，150 r/min下发酵72 h，然后测定生物量和虾青素产量，结果如图2。

从图2可以看出，牛肉膏对生物量和虾青素的积累最好，其次为酵母膏和蛋白胨，均为有机氮源。无机氮源中，柠檬酸三铵最利于虾青素的积累。虽然最利于菌体生长和虾青素积累的氮源是牛肉膏，但是牛肉膏的价格远远高于其他氮源，尤其是无机氮源。综合考虑虾青素的产量和生产成本，以牛肉膏和柠檬酸三铵为混合物作为发酵氮源，并通过试验进一步确定二者的最适配比为1∶2（质量比）。

2.3 Plackett-Burman试验设计与结果

根据上述单因素试验结果，以及其它文献报道，选择发酵培养基中的葡萄糖、复合氮源、酵母抽提物、MgSO4·7H2O、KH2PO4和 CaCl2浓度 6 个因素作为考察对象，应用Plackett-Burman试验设计法对各个因素的重要性进行研究。表头设计及试验列表见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果Table 1 Design and results of Plackett-Burman

利用MINITAB软件进行各因素主效应分析结果见表2。

表2 各因素水平及显著性分析效应值Table 2 Prominent analysis of factor levels and effect value

经分析检验得出可信度>90%的两个因素为葡萄糖和复合氮源，其他几个因素的可信度均<90%。因此，把酵母浸粉、硫酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙固定在原来的水平，选择葡萄糖和复合氮源进一步做响应面试验。对虾青素产量进行回归分析所得的系数的一次拟合回归方程为：

该方程的方差分析(ANOVA)表明,F=5.41。证明该模型在α=0.05水平显著，失拟项P值为0.042，表明失拟不显著。方程的相关系数R2为86.66%，调整后R2为70.65%，表明模型可以解释70.65%的虾青素提高水平的变化，说明方程的拟合度较好。

2.4 最陡爬坡试验

由表2的分析结果，对葡萄糖和复合氮源进行最陡爬坡试验，显著因素的变化步长及方向的试验设计及结果见表3。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and results of the most climb slope experiment

由表3可知，最佳条件处于第3组，所以选取这一组为中心点，即葡萄糖36 g/L，复合氮源4.5 g/L。

2.5 响应面分析的试验设计及结果

根据Plackett-Burman试验选择对虾青素有显著影响的因子，然后采用中心组合设计对这些因素进行进一步的优化。中心组合试验因素水平如表4，试验设计及结果如表5。利用MINITAB软件的多项式回归分析对数据进行拟合得到二次多项式，它是一个描述响应值（因变量）与影响因子（自变量）关系的模型。根据回归系数的显著性判断显著影响因素，以及各因素之间是否存在交互作用。最后进行验证试验，分析试验结果的可靠性，得到优化结果。

表4 中心组合试验因素水平表Table 4 Factor levels of central composed experiment

表5 中心组合试验设计及结果表Table 5 Design and results of central composed experiment

运用MINITAB软件对表5的试验设计做回归分析得到回归方程为:

该方程表达了虾青素产量与所选的两个因素之间的关系。回归方程的方差分析如表6，可以看出该回归模型在α=0.05水平显著，失拟项0.070，表明失拟不显著，该二次方程模型能很好的解释试验数据的变异性。方程的相关系数R2为94.17%，调整后的R2为90.01%，表明模型可以解释90.01%的虾青素含量水平的变化，说明该回归方程为培养基成分的优化提供了一个合适的模型。同时该方程的各因子与响应值之间高度显著。回归方程的一次项、二次项都高度显著，而回归方程的交互项不显著，因此各因子对响应值的影响不是简单的线性关系。

表6 回归方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

图3为响应面等高线图与立体图。

从图3中可直观地看出各因子对象应知的影响变化趋势，且回归模型确实存在最大值。利用MINITAB软件的响应优化器对响应进行优化，得到预测的响应为 11.89 mg/L，全局解为：X1=36.5，X2=4.5，即:葡萄糖加入量36.5 g/L，复合氮源为4.5 g/L时，可得到虾青素产量为11.89 mg/L。为了验证模型的正确性，利用上述条件做了验证试验，经过3次试验取平均值得到对于1 L的发酵培养基，葡萄糖添加量为36.5 g、复合氮源为4.5 g、磷酸二氢钾为1 g、酵母浸粉1 g、硫酸镁0.5 g和氯化钙0.1 g时，得到虾青素的量为11.81 mg/L，这与理论预测值相差不大，比优化前提高了近190%。因此，利用响应面法优化得到的培养基成分参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

通过优化发酵，在虾青素的生产过程中，碳源和氮源起主要作用。优化后的培养基为葡萄糖3.65%，复合氮源（牛肉膏：柠檬酸三铵=1∶2）0.45%，磷酸二氢钾0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.1%，CaCl20.01%。在此培养基的基础上进行500 mL摇瓶发酵，虾青素的产量为11.81 mg/L，比优化前提高了190%。本试验得到了产虾青素红法夫酵母液体培养基的一个非常合适的模型，同时说明响应面优化发酵条件卓有成效，为虾青素的进一步开发利用奠定了基础。

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Application of Response Surface Method in Fermentation Medium Optimization for Astaxanthin Production

HOU Juan,WANG Ji-hui*,YE Shu-hong,WANG Han
（School of Biology and Food Engineering,Dalian Polytechinic University,Dalian 116034，Liaoning,China）

2009-09-08

辽宁省创新团队计划（2007T009）；辽宁农业产业化计划（2007211001；2008301029）；大连市科技计划（2008B12NC059）

侯娟（1984—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

*通讯作者：王际辉，教授。