枇杷多酚氧化酶酶学特性的研究

史辉，郑玉平，阮少江，陈勇

（宁德师范学院生物系，福建宁德352100）

枇杷多酚氧化酶酶学特性的研究

史辉，郑玉平，阮少江，陈勇

（宁德师范学院生物系，福建宁德352100）

采用分光光度法，研究枇杷多酚氧化酶（PPO）的特性，包括不同温度、pH值、底物浓度和抑制剂对PPO活性的影响，以及PPO的热稳定性。结果表明：枇杷PPO的最适酶促反应温度为20℃；最适pH值为6.4；Km为0.020 mol/L，Vm为10.49ΔA/min·g·FW；80℃热处理50 s可钝化PPO的活性；抗坏血酸和亚硫酸钠为强烈抑制剂，质量分数为4227 mg/kg·FW的抗坏血酸和4537 mg/kg·FW的亚硫酸钠能有效抑制PPO的活性。

枇杷；多酚氧化酶；特性；褐变

Abstract:The Characteristics of polyphenoloxidase of loquat were studied in this thesis by spectrophotometry,including the effects of different temperature,pH,concentration of substrate and inhibitors on PPO activity,as well as stability to heat.The results showed that the optimum temperature of PPO was 20℃and the optimum pH was 6.4.Km value and Vm value of PPO were 0.020 mol/L and 10.49 ΔA/min·g·FW respectively.The extinct condition of PPO was 50 seconds at 80℃.Ascorbic acid and sodium sulfite were strong inhibitors,with the effective concentration being 4227 mg/kg·FW and 4537 mg/kg·FW respectively.

Key words：Loquat;polyphenoloxidase;property;browning

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）别名卢橘，属蔷薇科，是我国南方特有的珍稀水果。枇杷不但味道鲜美，营养丰富，而且有很高的保健价值。《本草纲目》记载“枇杷能润五脏，滋心肺”，中医传统认为，枇杷果有祛痰止咳、生津润肺、清热健胃之功效。而现代医学更证明，枇杷果中含有丰富的维生素、苦杏仁甙和白芦梨醇等防癌、抗癌物质。枇杷可酿酒；也可制成枇杷罐头、果脯、果汁。

九都镇是宁德市蕉城枇杷生产基地，现全镇已发展枇杷种植面积约460 hm2，并在进一步扩大，并逐渐形成该区主导特色农产品。但枇杷果实在加工和贮藏中极易褐变，影响产品色泽、风味，同时还破坏营养成分，严重影响水果的品质，这是导致其不耐贮藏和运输的主要原因，给生产带来巨大损失。

很多研究表明，果实在加工和贮藏过程中的褐变主要是酶促褐变，即组织体内的酚类物质在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下氧化成醌类，醌类再聚合形成褐色物质，从而导致组织变色[1]。正常的组织不发生褐变与细胞内酚类物质和酶的区域化分布有关[2]，在植物体内PPO主要存在于完整细胞的质体（包括叶绿体、有色体和白色体）和微体中，而PPO的底物存在于液泡中，当组织损伤引起亚细胞区域化改变时，则为底物和酶的接触创造了条件，引起褐变[3-4]。

不同果蔬中PPO的特性各不相同，人们已经对许多果蔬中的PPO特性进行了研究，如苹果[5]、梨[6]、香蕉[7]、山药[8]、莲藕[9]、马铃薯[10]、桃[11]、葡萄[12]、甜柿[13]。但对导致枇杷果实褐变的关键酶类——多酚氧化酶（PPO）的特性及影响该酶活性的因素的报道较少。为了深入探讨该酶促褐变的特性，本试验以枇杷果实为材料，研究了pH、温度、底物浓度、抑制剂等因素对多酚氧化酶活性的影响，以期为控制枇杷果实在加工和贮藏过程中的酶促褐变提供技术参数，对发展枇杷种植业，增加农民收入具有非常重要的经济意义和社会效益。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试枇杷品种为“解放钟”，采于宁德九都。选择成熟度一致、大小均匀、无病虫害、无机械伤、无褐变的果实。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂

邻苯二酚、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硫酸钠、抗坏血酸等主要试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2 主要仪器

高速冷冻离心机（3-18K）：Sigma；制冰机（AF100-AS）：Scotsman；低温冷却液循环泵（DL-1005）：南京先欧；电热恒温水浴锅（HH-6）、组织捣碎机（JJ-2）：上海比朗；可见分光光度计（VIS-7220N）：北京瑞利；微量移液器：芬兰雷勃。

1.3 方法

1.3.1 PPO酶液的制备

枇杷果实洗净去皮去核后，按1:1（g/mL）比例加入预冷的0.05 mol/L pH6.4磷酸盐缓冲液，低温捣碎至匀浆，10000 r/min离心20 min，上清液即为酶的粗提液，低温保存备用。

1.3.2 PPO活力的测定

参考黄建韶的方法略有改动[14]。在1 cm比色皿中，加入1.9 mL的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液和1 mL的0.1 mol/L邻苯二酚溶液，最后加入PPO酶液0.1 mL，在420 nm处比色测定PPO的活性，以蒸馏水作为空白对照。酶液加入后开始计时，混匀，30 s后第一次读数，然后每10 s记录一次OD420nm随时间的变化值。PPO活力定义为：每克鲜果肉每分钟引起吸光值的变化量，即 Un420=ΔA/min·g·FW（20 ℃，pH 6.4）。测量 3次，取平均值。

1.3.3 pH对PPO活性的影响

调整反应体系的pH水平，以0.4为一个pH梯度，在pH为4.0~8.0（柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：pH4.0~5.6，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液：pH6.0~8.0）的范围内测定PPO的活性。

1.3.4 温度对PPO活性的影响

以5℃为一个温度梯度，把0.1 mol/L磷酸缓冲溶液（pH6.4）、0.1 mol/L邻苯二酚溶液（pH为6.4的磷酸缓冲溶液）和酶液，置于10℃~50℃范围内的不同温度的水浴中保温10min后，加入1cm比色皿中，在420nm处比色测定PPO的活性。

1.3.5 底物浓度与PPO活性的关系

以0.01 mol/L为一个浓度梯度，测定0.01 mol/L~0.1 mol/L不同浓度邻苯二酚溶液对PPO活性的影响。

1.3.6 抑制剂对PPO活性的影响

以0.1 mmol/L为一个浓度梯度，测定0.1 mmol/L~0.6 mmol/L不同浓度的亚硫酸钠和抗坏血酸对PPO活性的影响。

1.3.7 PPO热稳定性的测定

将PPO酶液分别在60、70、80℃水浴中处理一定时间后，立即放冰浴冷却5 min后，在20℃下测定PPO的残留活性（pH6.4）。

2 结果与讨论

2.1 温度和pH对PPO活性的影响

温度和pH对PPO活性的影响见图1。

如图1（a）所示，枇杷PPO在20℃时活性最高，为枇杷PPO的最适温度，高于或低于20℃时酶活性急剧下降。温度对PPO反应速度的影响包括两个方面：一，因温度升高对酶的结构产生不利影响，从而使酶活力下降；二，温度升高又加快反应速度，一般来说，每当温度增加10℃，酶促反应速度增加1倍，因此，PPO的最适温度是这两种影响综合作用的结果[15]。20℃以下时，温度对枇杷PPO酶促反应的加速起主导作用，但温度继续升高时，高温对酶蛋白的破坏起主导作用，PPO的活性呈下降趋势，至温度更高时PPO失活。在生产工艺中，对枇杷鲜果可采用低温冷藏的方法来抑制酶促褐变，而对加工产品则可通过适当的热处理来达到一定的防褐效果。

从图1（b）中PPO相对活性与pH值的关系曲线可知，枇杷PPO最适pH值为6.4，偏酸性。pH值对枇杷的PPO活性影响很大，体现了PPO活力强烈依赖于pH值的大小。因为PPO为含铜蛋白酶，当pH值较低时，一方面，酶中的铜被解离出来，使酶失活；另一方面，酸性条件下，蛋白质变性也使酶失活，当pH值较高时，铜与酶蛋白脱离，生成不溶性Cu(OH)2，也会使酶失活[6]。因此，在枇杷果实加工过程中调节pH值可减少褐变的发生。

2.2 底物浓度对PPO活性的影响及酶促反应动力学研究

底物浓度对PPO活性的影响结果见图2。

从图2（a）可以看出，邻苯二酚的浓度对反应初速率的影响很大，在浓度较小时呈直线上升，当底物浓度继续增加时反应速度增加缓慢，不再呈直线关系，最后趋于极限值。这是由于在底物浓度较低时，并非所有的酶分子都能与底物相结合。随着底物浓度增加，越来越多的酶分子都与底物结合，此时酶被底物饱和，进一步提高底物浓度也不能提高酶的活性[16]。

以邻苯二酚为底物，如图2（b）所示，根据Lineweaver-Burk作图法，以1/V为纵座标，1/S为横座标作图，得到回归方程：y=0.0019x+0.0953相关系数R=0.9987。根据米氏方程：1/V=（Km/Vm）×（1/S）+1/Vm，1/Vm=0.0953，Km/Vm=0.0019。求得Km即米氏常数为0.020mol/L，Vm既酶催化反应速度最高值为10.49△A/min·g·FW。Km值代表反应速度达到最大速度一半时的底物浓度，反应酶与底物的亲合力，Km越小，酶与底物的亲合力越大[16]。在测定酶活性时可通过Km大小选择酶的最适底物（Km值最小的底物）及其用量（大于Km值的5倍），从而使测定的结果更为可靠[17]。

2.3 抑制剂对PPO活性的影响

抑制剂对PPO活性的影响见图3。

抗坏血酸、亚硫酸钠对PPO活性的抑制作用如图3（a）可知，随着各抑制剂浓度的增加，PPO活性也随着下降。多酚氧化酶是一种含铜的酶。该酶的抑制剂可以有两种类型：一种是与酶中铜起作用抑制酶活性；另一种是通过影响底物(如酚类化合物)与酶活性中心结合部位的作用而抑制酶的活性。抗坏血酸对PPO活性的抑制机理主要是将Cu2+还原成Cu+，同时抗坏血酸具有还原性，能把酶促反应的中间产物——邻苯醌还原成邻苯二酚而抑制褐变[18]；亚硫酸钠主要是通过不可逆地与醌形成稳定的无色加成物而抑制褐变[19]，与此同时，降低了酶作用于一元酚和二羟基酚的活力。由图3（a）可知，抗坏血酸和亚硫酸钠对PPO均有明显抑制效果，浓度为0.4 mmol/L的抗坏血酸和0.6 mmol/L的亚硫酸钠能有效抑制PPO的活性，换算成质量分数即为4227 mg/kg·FW的抗坏血酸和4537 mg/kg·FW的亚硫酸钠能有效抑制PPO的活性。抗坏血酸为枇杷的固有营养成分，安全性高，抑制效果可以完全取代化学药剂（亚硫酸钠），是理想的抑制剂；而亚硫酸钠则要考虑亚硫酸盐在果实制品中的残留。由图3（b）可知，浓度为0.06 mol/L即质量分数为756.5 g/kg·FW的柠檬酸能有效抑制PPO的活性，可知柠檬酸不是PPO的抑制剂，柠檬酸对PPO的活性的影响主要是通过调节反应体系的pH值来实现的；且柠檬酸的用量太大，通过其调节PPO的活性不经济。

2.4 PPO的热稳定性

PPO的热稳定性结果见图4。

多酚氧化酶是蛋白酶，其活性部位空间结构的完整性对保持酶的活力是必要的，任何影响酶空间结构完整性的因素将影响它的活力。由图4 a图可以看出，枇杷PPO比较耐高温，60℃高温处理时，随着处理时间的延长，酶促反应速度呈下降趋势，但处理时间超过4 min时其活性下降变缓慢并趋与平衡，处理10 min后还残留30%的活性，意味着该温度下短时间处理，不能有效灭活酶的活性。70℃高温处理时，1 min后其活性只有44.6%，2 min后其活性只有10.9%，到4 min时其活性几乎丧失。由图4 b图可知，在80℃下处理50 s就可以使PPO活性完全失活。因此可以使用高温处理的方法钝化PPO，但高温处理时间太长会破坏营养成分及风味，故在枇杷加工过程中可采用不低于80℃的高温瞬时热烫来钝化PPO的活性，也可以结合其它手段来达到抑制褐变的目的。

3 结论

本试验针对从枇杷果实中提取的多酚氧化酶，对其特性进行研究，以邻苯二酚为底物，测定了不同pH值、温度、底物浓度和抑制剂对多酚氧化酶活性的影响。结果表明，pH值、温度、抑制剂和底物浓度显著影响多酚氧化酶的活性，体现了酶对反应介质的强烈依赖性。以邻苯二酚为底物，枇杷PPO的最适酶促反应温度为20℃；最适pH值为6.4；Km为0.020 mol/L，Vm为 10.49ΔA/min·g·FW；80℃热处理 50 s可钝化 PPO的活性；抗坏血酸和亚硫酸钠为强烈抑制剂，质量分数为4227 mg/kg·FW的抗坏血酸和4537 mg/kg·FW的亚硫酸钠能有效抑制PPO的活性。在枇杷果实加工过程中应根据具体情况选择适当的处理温度（瞬时热烫），并通过改变pH或添加抑制剂等方法来达到抑制褐变的目的。

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Study on Characteristics of Polyphenoloxidase in Loquat

SHI Hui，ZHENG Yu-ping，RUAN Shao-jiang，CHEN Yong
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，Fujian，China）

2009-08-24

宁德师范高等专科学校校级科研资助项目(2009202)

史辉(1979—)，男(汉)，讲师，硕士，研究方向：果品保鲜与生物技术。