甘露寡糖对罗非鱼肠道菌群的影响

汪立平，马相杰，冷向军，赵 勇

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海海洋大学，省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海200090）

甘露寡糖对罗非鱼肠道菌群的影响

汪立平1，马相杰1，冷向军2，赵 勇1

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海海洋大学，省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海200090）

考察饲料中添加自制酵母甘露寡糖、外购甘露寡糖和黄霉素对奥尼罗非鱼肠道菌群的影响。实验以平均初重20.04±0.13g的奥尼罗非鱼为实验对象，在基础饲料中分别添加0.00%（对照组）、0.5%的自制酵母甘露寡糖、0.5%的外购甘露寡糖和8mg/kg黄霉素。传统菌落计数结果表明，各添加剂都能明显改变幼鱼肠道中的乳酸杆菌和大肠杆菌的数量及比例，饵料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖更能优化罗非鱼肠道微生物的微生态环境。DGGE图谱分析表明，自制酵母甘露寡糖、外购甘露寡糖、黄霉素的加入都改变了罗非鱼原有的肠道微生物的微生态环境，其中自制酵母甘露寡糖对罗非鱼肠道微生物的微生态影响更大。

罗非鱼，甘露寡糖，肠道菌群，DGGE

Abstract：This research studied the effects of homemade yeast mannan-oligosaccharides，purchased mannanoligosaccharides and flavomycin on the intestinal flora of tilapia.The study focused on the average initial weight 20.04±0.13g of tilapia，the basic diets were formulated to contain 0.5%home-made yeast mannanoligosaccharides，0.5%purchased mannan-oligosaccharides and 8mg/kg flavomycin，respectively，and the control contained no mannan-oligosaccharides or flavomycin.The result from plate count method showed the number and portion of lactic acid bacteria and E.coli from intestinal tract of juvenile tilapia were significantly affected by different addictives.The intestinal microbial micro-ecological environment of juvenile tilapia was optimized by homemade yeast mannan-oligosaccharides.The DGGE fingerprint showed that the original tilapia intestinal microbial micro-ecological environment was changed by homemade yeast mannan-oligosaccharides，purchased mannan-oligosaccharides and flavomycin.In contrast to the other two addictives，homemade yeast mannan-oligosaccharides had more impact on the intestinal microbial micro-ecological environment of tilapia.

Key words：tilapia；mannan oligosaccharides；intestinal microflora；DGGE

近年来研究发现，甘露寡糖不仅具有低热、稳定、安全、无毒等良好的理化性质，还具有调整肠道和提高免疫等保健功能。畜禽饲料中添加甘露寡糖能明显改善胃、肠道微生态环境，促进乳酸杆菌等有益菌的增殖，抑制大肠杆菌的增殖，大大降低了腹泻率［1-4］。鱼类消化道微生物易受饵料的影响［5-8］，而目前，在鱼类饵料中添加甘露寡糖的研究较少，仅见鲤鱼（Cyprinus carpio）［9］、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）［10］等少数品种。由甘露寡糖在饲料中的应用效果来看，甘露寡糖是抗生素的理想替代品。罗非鱼是我国重要的出口水产品，其安全性和抗生素的替代品研究更为受到关注。除红罗非鱼外，目前尚未见甘露寡糖在罗非鱼饲料中的研究报道。因此，本实验以奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.aureus）为研究对象，通过在饲料中添加自制酵母甘露寡糖，并与市售甘露寡糖、黄霉素做比较，利用传统菌落计数法和变性梯度凝胶电泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）考察在罗非鱼鱼体生长过程中对罗非鱼肠道菌群的影响，以期为抗生素的替代品提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

酵母甘露寡糖 取实验室保藏的β-甘露聚糖酶菌株，在发酵培养基中活化，按10%的接种量接种到1000L的三角瓶中，摇床培养（200r/min）48h，500r/min离心5min，去除杂质，上清液于9000r/min、4℃下，离心10min，取上清液即粗酶液。酵母细胞壁100g加入94.5mL水和5.5mL酶液，调节pH到6.0，55℃水浴4.5h后，烘干后制成粉末备用；鱼种 采用平均体重20.04±0.13g的奥尼罗非鱼，选用规格一致、体质健壮的个体，共240尾，随机分配于12口缸中（4个处理组，每处理3个重复），每缸20尾鱼；伊红美兰琼脂培养基（EMB）、MRS琼脂培养基（MRSA） 北京路桥技术有限责任公司；DGGE-PCR引物 V3-2（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′），V3-3（5 ′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′） 由上海生工生物工程公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 养鱼实验设计 在基础饲料中分别添加0.0%（对照组）、0.50%自制酵母甘露寡糖（等量减少麦麸用量）、0.5%外购甘露寡糖、8mg/kg的黄霉素，共4个处理组，每处理3个重复。各种原料均过40目筛，搅拌均匀，挤压机制成直径2.0mm的半沉性颗粒饲料。基础饲料组成见表1。

实验Ⅱ：在基础饲料中添加，各种原料过60目筛。

表1 基础饲料组成

1.2.2 实验管理 实验用鱼饲养于12口自动充气循环控温的水族箱中（0.8m×0.5m×0.5m）。用基础饲料驯化1周，待鱼摄食正常后开始实验，日投喂3次（8∶30，12∶30，15∶00），投饵率为体重的 3%～5%。实验期间水温 25±1℃，DO ＞5mg·L-1，NH3-N ＜0.3mg·L-1，昼夜充气，共 30d。

1.2.3 大肠杆菌和乳酸杆菌的测定 取奥尼罗非鱼，在无菌操作台上进行鱼样处理，将收集的鱼肠道样品0.5g放到灭菌处理的10mL离心管中，做梯度，稀释倍比稀释一直到10-7。用移液枪吸取适量稀释度的样品100μL，接种到选择性培养基上涂匀，每个稀释度做3个平行样。在37℃条件下培养48h。培养结束后进行记数（每克鱼肠标本的活菌数），取其平均值。剩余鱼肠放在-20℃下备用。

1.2.4 鱼肠道微生物总DNA的提取 精确称取100mg鱼肠道样品置于灭菌处理的10mL离心管，按照文献［11］提取肠道微生物总DNA，将提取的DNA样品置于-20℃下冷冻保存备用。

1.2.5 DNA质量检测 0.8%琼脂糖TAE buffer电泳EB染色凝胶成像仪观察分析；核酸蛋白分析仪检测总DNA浓度和纯度。

1.2.6 PCR扩增与变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析针对16S rDNA V3区片段的PCR扩增，扩增反应体系为25μL，模板DNA约50ng。扩增程序为94℃，5min、25 个循环（94℃，1min、56℃，1min、72℃，2min）后72℃、10min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳、EB染色、凝胶成像仪观察分析。PCR产物进一步用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分离。凝胶变性梯度为35%～55%，电压为120V，电泳缓冲液为1×TAE，60℃电泳3h，用Sybergreen染色后凝胶成像仪观察分析。

1.2.7 图像处理及数据分析 利用NTSYS 2.10中的UPGMA做不同饲养条件下的肠道微生物菌群聚类分析。以Rf值为标记，对DGGE图谱条带采用二态编码，即有条带存在的编码为“1”，无存在的则编码为“0”，利用 Jaccard［12］系数对不同饲养条件下的罗非鱼肠道微生物菌群的相似性进行分析。

2 结果与分析

2.1 实验结果

由表2可知，用添加自制酵母甘露寡糖、外购甘露寡糖和黄霉素的饲料喂养罗非鱼，对罗非鱼肠道中的大肠杆菌和乳酸杆菌的数量有明显的影响。在罗非鱼饵料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖、0.5%的外购甘露寡糖和8mg/kg的黄霉素与对照组比较，分别使乳酸杆菌增加22.09%、23.69%和2.81%，使大肠杆菌分别减少了18.67%、18.53%和29.47%。

从乳酸杆菌与大肠杆菌的比值来看，饲料中添加酵母寡糖、外购甘露寡糖和黄霉素都能明显改变乳酸杆菌在肠道中的比例，饵料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖组比值最高，与其它组比较更好地优化了罗非鱼肠道微生物的微生态环境。

2.2 鱼肠道微生物总基因组总DNA的提取

图1 罗非鱼肠道微生物总DNA电泳图

分别对实验中罗非鱼4个样品的肠道微生物基因组总DNA进行提取，如图1，从电泳图中看出，得到了清晰的鱼肠道微生物总DNA条带，且条带在23000bp左右。结果见表3，提取的罗非鱼肠道微生物总DNA的OD260/280在1.8左右，得到了较纯的DNA样品，浓度在50～90ng/μL之间，可以满足PCR的要求。

表2 甘露寡糖对罗非鱼生长中肠道微生物的影响

表3 罗非鱼肠道微生物总DNA浓度和OD260/280值

2.3 鱼肠道微生物16S rDNA的V3可变区PCR扩增结果

以上述提取的微生物总基因组DNA为模版，用16S rDNA的V3可变区引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，均获得200bp左右的特异性扩增片断，从图2中来看，样品都有较亮的扩增条带，本实验的PCR扩增条件是比较合适的，适合用于接下来的DGGE电泳分析。

图2 罗非鱼肠道微生物16S rDNA-V3区片段PCR扩增图谱

2.4 不同饲养条件下16S rDNA-DGGE指纹图谱建立、聚类分析及相似系数分析

对实验Ⅰ、Ⅱ中罗非鱼肠道微生物16S rDNA V3区片段的DGGE指纹图谱及聚类分析结果如图3所示。

图3 罗非鱼肠道微生物16S rDNA的PCR-DGGE指纹图谱（左）及聚类分析（右）

由图3可知，在罗非鱼饵料中添加0.5%的自制甘露寡糖、0.5%外购甘露寡糖和8mg/kg黄霉素都会明显改变罗非鱼肠道微生物的微生态环境，说明鱼肠道微生物易受饵料的影响，由聚类分析图可以看出，0.5%的自制甘露寡糖、0.5%外购甘露寡糖相似度最高，达到0.86，属于一类；对照组和黄霉素组相似度为0.68，属于一类；两类之间的差别较大。

由表5可知，不同饲养条件下的罗非鱼肠道微生物相似系数分布范围为0.47～1.00。对照组与自制酵母甘露寡糖样、外购甘露寡糖样和黄霉素样的相似系数分别是0.51、0.59、0.68，属于中等相似，说明罗非鱼饵料中添加自制甘露寡糖、外购甘露寡糖和黄霉素都使罗非鱼原有肠道微生物的微生态发生改变；自制甘露寡糖样和外购甘露寡糖样的相似系数为0.81，属于极相似，说明自制甘露寡糖和外购甘露寡糖在改变罗非鱼肠道微生物微生态的效果上相近；自制甘露寡糖样与黄霉素样相似系数为0.78，属于极相似，说明0.5%的自制甘露寡糖添加量就能达到8mg/kg黄霉素添加量的效果，可以作为替代黄霉素的参考；外购甘露寡糖样与黄霉素样相似系数为0.47，属于中等不相似，说明罗非鱼饵料中添加0.5%的外购甘露寡糖和8mg/kg黄霉素对影响罗非鱼肠道微生物的微生态效果上存在较大的差别。

表5 不同饲养条件下的罗非鱼肠道微生物相似系数

3 讨论

本研究表明，在罗非鱼饵料中添加自制酵母甘露寡糖和外购甘露寡糖都能改变肠道微生态环境，促进乳酸杆菌有益菌的增殖，抑制大肠杆菌的增殖。这与甘露寡糖对猪、鸡和牛肠道微生物菌群的影响结果相似。由实验结果可知，在罗非鱼饵料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖、0.5%的外购甘露寡糖比添加黄霉素更能优化罗非鱼肠道微生物的微生态环境。

在DGGE指纹图谱中条带的有无与亮暗代表不同的微生物的有无和数量的差异，由DGGE指纹图谱和聚类分析结果可知，添加自制酵母甘露寡糖组、外购甘露寡糖组和黄霉素组与对照组比较，明显有属于自己的特有条带和与对照组同一水平上不同亮度的条带，说明自制酵母甘露寡糖、外购甘露寡糖、黄霉素的加入都明显改变了罗非鱼原有的肠道微生物的微生态环境。聚类分析结果显示，添加自制酵母甘露寡糖组和外购甘露寡糖组最相近，与对照组距离较远，属一类；添加抗生素组与对照组距离较添加自制酵母甘露寡糖组和外购甘露寡糖组较近，属于一类。由相似系数表知，添加黄霉素组较添加自制酵母甘露寡糖组和外购甘露寡糖组与对照组的相似系数更大，说明黄霉素虽然明显改变罗非鱼肠道中乳酸杆菌和大肠杆菌的数量，但对罗非鱼肠道的微生态影响较自制酵母甘露寡糖和外购甘露寡糖要小。

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Effect of mannan oligosaccharides on intestinal microflora of ti/apia

WANG Li-ping1，MA Xiang-jie1，LENG Xiang-jun2，ZHAO Yong1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Fisheries University，Shanghai 200090，China）

TS254.1

A

1002-0306（2010）10-0142-04

2009-10-09

汪立平（1968-），女，副教授，主要从事功能性低聚糖、饮料酒的科学与技术研究及豆制品精深加工研究。

上海市教育委员会项目（07ZZ137）。