降血压肽制备工艺的研究进展

肖 平，周丽珍，李 艳，刘 冬，*

(1.深圳职业技术学院，广东深圳518055;2.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004)

降血压肽制备工艺的研究进展

肖 平1，2，周丽珍1，李 艳1，刘 冬1，*

(1.深圳职业技术学院，广东深圳518055;2.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004)

综述了降血压肽制备工艺的研究现状，指出基因工程法结合层析技术是今后降血压肽制备研究的主要方向。

降血压肽，制备工艺，酶法，基因工程法

Abstract:The preparation progress of antihypertensive peptides was reviewed.Gene engineering combined with chromatography separation was indicated to be the main research direction for the antihypertensive peptides preparation in the future.

Key words:antihypertensive peptides;preparation technology;enzymic method;genetic engineering method

降血压肽(antihypertensive peptides，AHP)是一类能够显著降低高血压病人血压的多肽总称。它是血管紧张素转化酶(agiotensin converting enzyme，ACE)的抑制剂，能够通过抑制人体肾素－血管紧张素系统中血管紧张素II的生成而达到降低血压的目的，因此降血压肽又称血管紧张素转化酶抑制肽(agiotensin converting enzyme inhibitor peptid，ACEIP)。与目前一线临床常用的 ACE抑制剂(agiotensin conver－ting enzyme inhibitor，ACEI)类抗高血压药物相比，降血压肽只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无明显降压作用，且无任何毒副作用［1－2］，因此，是一种极具开发潜力的多肽类抗高血压药物。许多动物、植物、微生物蛋白及发酵食品中都含有丰富的降血压肽。迄今，许多研究者采用酶解法结合不同的分离纯化工艺从这些天然蛋白质中得到了一系列具有降压效果的多肽单体［3－4］，但由于天然蛋白中降血压肽含量低、分离纯化过程复杂等原因导致产品成本过高，至今仍无商业化产品面市。采用微生物基因工程法大规模表达降血压肽克服了天然原料降血压肽含量有限的缺点，但分离纯化工艺仍是当前制约降血压肽产业化生产的瓶颈。本文全面综述和评价了迄今文献报道的降血压肽的制备工艺技术，以期为其他研究者和降血压肽产业化生产提供一定的参考。

1 从天然蛋白质中制备降血压肽

天然蛋白中含有大量具有ACE抑制活性的降血压肽，因此，以天然蛋白为原料，利用蛋白酶水解结合各种分离纯化技术制备降血压肽成为降血压肽制备研究的主要方法。也有研究人员从一些天然食物和发酵食品中直接提取ACE抑制肽。

从天然蛋白中制备分离降血压肽的一般工艺流程是:

图1 从天然蛋白中制备分离降血压肽的一般工艺流程

采用酶解法制备降血压肽技术的关键环节是含有高活性、高含量降血压肽的天然蛋白质原料的选用、特异性酶的选择以及各种分离纯化技术的选择与优化。

1.1 原料的选择

迄今，许多学者分别成功地从酪蛋白、乳清蛋白、乳酸菌提取物、清酒、酒糟、酸奶、蛇毒、明胶、牛皮凝胶、虾蟹、鲣鱼、鲢鱼、沙丁鱼、金枪鱼、玉米、大豆、麦胚、紫菜、花生、无花果、茶叶、大蒜等中通过酶解、发酵等方法经分离纯化得到了大量不同序列的AHP［5－6］。目前，从新的动物、植物及微生物原料中发现和分离鉴定新的降血压肽仍然是降血压肽研究的热点领域。

含有高活性、高含量降血压肽单体的蛋白质原料的选用是获取高活性、高疗效AHP产品的前提条件。从目前已报道的具有降血压肽活性的多肽氨基酸组成来看，虽然各种降血压肽没有固定的氨基酸组成和结构，但绝大多数高活性的降血压肽主要由疏水性氨基酸组成，如大多数降血压肽的C－末端都具有辅氨酸;C－末端倒数第三个氨基酸为芳香族氨基酸有助于ACE抑制剂与ACE的结合;疏水性氨基酸对于肽正确进入ACE活性中心是必要的［7］。因此，富含此类氨基酸的蛋白质适合作为酶法生产降血压肽的原料。

表1 国内外学者从天然蛋白中分离出的AHP

1.2 蛋白水解酶的选择

天然蛋白经过蛋白水解酶的催化可以释放出许多种具有降血压活性的多肽。由于一般不知道原料蛋白质的一级结构，并且ACE抑制肽也没有一个固定的结构，所以酶法生产ACE抑制肽存在一定的盲目性。实际生产中对酶种类和酶解工艺的选择没有固定的方法，需要通过不断的实验摸索来确定最佳的酶和水解工艺条件，主要参考以下几个方面来对酶进行筛选。

选择的酶多为内肽酶，而不是端肽酶，这样可以避免产生过多的游离氨基酸而影响后续的多肽分离。酶解时，根据不同的原料及工艺要求选择不同种类的酶，可以是用单一酶进行酶解，也可以用两种或多种酶共同进行反应。不同的蛋白酶水解产生的多肽活性不同。吴建平等人的研究表明，多酶法的作用效果与单酶法相比并没有明显的优势［8］。降血压肽活性与其结构有着密切的关系，如C－末端氨基酸为芳香族氨基酸和脯氨酸时与ACE结合能力很强，ACE活性较高;N－末端最具活性的是长链或者具有支链的疏水性氨基酸，而当N端为Pro时活性降低;可以看出降血压肽结构与活性的关系对蛋白水解酶系的筛选具有重要的指导意义［9］。另外在选择酶时最好根据酶水解的特异性进行选择，如胰凝乳蛋白酶水解由芳香族氨基酸的羧基所形成的肽键;胃蛋白酶能迅速水解由芳香族氨基酸的氨基和其他氨基酸形成的肽键，也能较缓慢地水解其他一些氨基酸(如Leu)和酸性氨基酸参与形成的肽键;碱性蛋白酶也有终端疏水性氨基酸的专一性，主要水解疏水性氨基酸如:Leu、Ile、Val等的终端;嗜热菌蛋白酶水解由 Val、Leu、Ile、Phe、Typ、Met等疏水性氨基酸的氨基端形成的肽键［5］。对于酶的选择还要考虑来自于原料的影响，如玉米醇溶蛋白的嗜热菌蛋白酶水解物降血压活性非常高，这除与该蛋白酶的作用位点有关外，还因为玉米醇溶蛋白有较高含量的Pro及其它疏水性氨基酸［7］。

目前已经应用在降血压肽生产的蛋白酶主要有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原蛋白酶等［5］。

1.3 分离纯化工艺选择

多肽类分离提取常用的方法包括:超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、HPLC、RP－HPLC、薄层色谱、毛细管电泳等。由于许多ACE抑制肽结构很接近，食物蛋白质酶解成分相当复杂，需要综合考虑多肽分子量分布、电荷种类和带电量以及分子极性大小等理化性质，然后再选用不同的分离纯化单元操作技术对其进行分离纯化，以达到更好的分离效果。大体的分离步骤是先用沉淀离心或活性碳吸附的方法除去较高分子量、未水解的蛋白质，用超滤除去不溶底物、分子量较大蛋白质和肽类以获得合理的氨基酸和短肽，再根据分子量大小，采用凝胶过滤分离得到目的短肽，如果ACE抑制肽结构相近，则需根据电荷、分子极性差异等性质结合离子交换层析、疏水层析和RP－HPLC等其它分离方法来达到分离目的。

表1列举了部分国内外学者采用不同的分离纯化工艺从天然蛋白中分离出的AHP。

从目前降血压肽分离纯化研究的报道中可以看出，采用单一方法往往难以获得较好的分离效果，大多属于初步分离，在进行分离纯化时，最好是将分离原理不同的2种或多种手段结合使用，从而获到更高纯度的降血压肽组分。这也可能成为今后降血压肽分离纯化研究的一个主要方向。

2 基因工程法制备降血压肽

现在，利用基因工程技术生产药物、食品原料已越来越多，如利用基因工程法生产抗菌肽、干扰素等肽类药物已经产业化，为利用基因工程技术制备降血压肽提供了借鉴。

利用基因工程法制备分离降血压肽的一般工艺流程是:

图2 利用基因工程法制备分离降血压肽的一般工艺流程

利用基因工程技术制备降血压肽的关键环节是降血压肽基因表达系统的构建和下游分离纯化技术的选择及工艺条件的优化。

2.1 基因表达系统的选择与构建

应用于重组降血压肽的常用的基因表达系统有大肠杆菌和酵母表达系统等。大肠杆菌表达系统因其具有低廉性、高效性、稳定性、操作简单和可以大规模发酵培养等优点而被广泛应用［21］。酵母既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特点，同时又具有真核生物蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等的功能，因此，酵母现已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的宿主［22］。构建降血压肽基因表达系统的大致流程是:选择高降血压活性的多肽单体并设计能在表达系统内高效表达的降血压肽基因序列，克隆至表达载体并转接至宿主菌中高效表达。

利用基因工程技术生产小分子肽，困难在于小分子肽产物易被降解和表达量低。目前解决这个问题的主要方法是采用融合蛋白表达、在蛋白酶缺陷宿主菌中表达和增加基因拷贝等技术。融合蛋白表达技术是通过将目的基因引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高效表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。目前使用最广泛的蛋白酶缺陷性宿主菌为E.coli BL21及其衍生菌株，它的优点在于缺失Lon和OmpT蛋白酶，可有效防止表达的外源蛋白的降解。增加基因串联表达的基本思路是，在小肽基因两端引进限制性核酸内切酶酶切位点，利用其酶切后产生的粘性末端，经连接酶连接，体外构建其多拷贝的小肽基因［7］。

G.S.Lv等成功构建出降血压肽基因:FFVAPFPEVFGK(Phe－Phe－Val－Ala－Pro－Phe－Pro－Glu－Val－Phe－Gly－Lys)，克隆至表达载体 pQE16 并转化E.Coli JM109，IPTG诱导表达，SDS－PAGE电泳检测，融合蛋白(二氢叶酸还原酶－AHP)表达的量达到 500μg/L［23］。刘冬等选择 KVLPVP(Lys－Val－Leu－Pro－Val－Pro)为理想降血压肽序列，利用胰蛋白酶的特异位点－Arg↓和羧肽酶B特异位点－Pro↓Arg将选定的六肽连接成6拷贝的串联四十二肽，根据大肠杆菌偏爱密码子合成重组降血压肽基因序列，克隆至原核表达载体 pGEX－4T－2，并转化 E.Coli BL21(DE3)，SDS－PAGE电泳检测，融合蛋白 GSTAHP(谷胱甘肽S－转移酶－降血压肽融合蛋白)占大肠杆菌胞内总蛋白的23%［24］。

目前，也有研究人员不通过融合蛋白表达技术，而直接将降血压肽基因克隆至表达载体，以串联多聚体形式在宿主菌中表达。HASAN.MD等构建出降血压肽基因PTHIKWGD，并编码串联重复成一T6拷贝的多聚体，克隆至表达质粒 pK2TF－TP，并转化E.Coli BL21(DE3)，1mmol/L IPTG诱导表达，重组串联肽以包含体形式表达，表达量为330mg/L，约占大肠杆菌胞内总蛋白的55%。包含体通过酸水解后裂解成单一肽PTHIKWGD，并通过免疫亲和层析和RP－HPLC法可得到完全纯化，降血压肽的含量为105～115mg/L培养基，经过人工胃液或酸水解后生物活性没有发生变化，IC50为 2μmol/L［25］。这一新颖的方法克服了传统的融合蛋白表达技术，水解纯化工艺更加简单，成本少，产量高，拥有相当广阔的发展前景。

2.2 分离纯化工艺选择

相比酶解法制备分离降血压肽水解产物复杂、分离产物不明确、分离纯化环节多，利用基因工程技术制备分离降血压肽的目标明确，分离纯化工艺更为简单。通常采用离心技术、超滤技术、大孔树脂吸附技术等方法对降血压肽进行粗提取，然后根据被分离目标多肽分子量、电荷大小或分子极性等性质选用离子交换层、凝胶过滤、亲和层析、RP－HPLC等分离纯化技术对目标物进行进一步纯化。当前，如何实现降血压肽的产业化生产是所有研究者面临的最大难题，这直接影响到降血压肽推广应用的前景，建立一套适宜的分离提取技术工艺是将降血压肽推向商业化生产的必要条件，分离提取的效率将直接影响到ACE抑制肽的应用前景。

刘冬等在对利用基因工程技术生产降血压肽研究中，采用亲和层析法对GST－AHP进行分离，GSTAHP吸附量达3.86mg/mL，回收率达到96.5%，并通过RP－HPLC法对降血压肽进行纯化，可实现降血压肽的完全分离，重组降血压肽 KVLPVP的 IC50为4.6μmol/L，对ACE为竞争性抑制，动物实验表明，给药剂量为300μg/kg(体重)时，AHP对高血压大鼠具有显著降压效果，而对血压正常大鼠无显著的降血压作用［24］。卢真保在刘冬等人已构建好的降血压肽基因表达系统的基础上，采用HPD－100B型大孔吸附树脂对降血压肽 VLPVPR(Val－Leu－Pro－Val－Pro－Arg)进行分离，上样量180mL，上样流速3mL/min，上样结束后用水和8%乙醇各洗涤60mL，流速均为1mL/min，而后改用60%乙醇以0.25mL/min洗脱45mL，此工艺下VLPVPR的回收率为92.7%，纯度为28.8%，比纯化前提高了65倍，体外检测对ACE具有较强的抑制活性，其 IC50为 4.1μmol/L［26］。

3 总结与展望

目前，降血压肽主要采用蛋白酶酶解法从天然蛋白中分离纯化获得，该方法存在天然原料降血压肽含量低、专一性蛋白酶筛选繁琐、水解产物复杂、分离纯化环节多、产量低、产品成本高等问题，这些问题制约了降血压肽的产业化。利用基因工程技术生产降血压肽不受原料来源限制、生产周期短、下游分离纯化工艺简单，是克服上述困难进行大规模生产的重要途径，具有广阔的应用前景，这也可能将成为今后降血压肽研究发展的一个趋势。

大量研究表明，多种层析技术是进一步高度纯化降血压肽的有效工具，采用多种分离方法分步骤结合使用，可以实现降血压肽的高度纯化。基因工程法相比酶解法拥有更多的优越性，基因工程技术结合层析技术制备分离降血压肽可能将成为今后研究发展的主要方向之一。同时，采用串联多聚体表达技术代替融合蛋白表达技术构建基因表达系统、发掘采用更多新型高科技层析填料应用于降血压肽的分离纯化等研究将更加广泛地推动降血压肽的发展。

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Progress of preparation technology on antihypertensive peptides

XIAO Ping1，2，ZHOU Li－zhen1，LI Yan1，LIU Dong1，*
(1.Shenzhen Vocational and Technical College，Shenzhen518055，China;2.College of Light Industry and Food Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China)

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0417－05

2009－07－24 *通讯联系人

肖平(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:食品生物技术。

广东省科技厅科技攻关项目(2206K045BA)。