维生素C对A549细胞增殖、凋亡及Caspase-3、Survivin表达的影响

翟鹏勇 曾锦荣 谭宁 王绩英 黄岚珍 佘巍巍

维生素C（Vitamin C, Vit C）是一种具有6个碳原子的酸性多羟基化合物。其分子中2位和3位碳原子的两个烯醇式羟基极易解离，释放出H+，而被氧化成脱氢Vit C。Vit C和脱氢Vit C在人体内形成可逆的氧化还原系统，此系统在生物氧化、还原作用及细胞呼吸中起重要作用。Vit C作为细胞保护剂广泛应用于临床多种疾病（如坏血病、肝硬化等）的治疗。近年来，研究[1]发现Vit C可以促进肿瘤细胞的凋亡，但具体机制尚未完全阐明。本研究将探讨Vit C对肺癌A549细胞株的增殖、凋亡的影响及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料与实验分组

1.1.1 实验材料 肺癌细胞株A549由中山大学附属肿瘤医院惠赠，DMEM培养液（GIBICOL公司），小牛血清（GIBICOL公司），Vit C（广州南国药业有限公司），CCK-8试剂（大连宝生物有限公司），RT-PCR反应体系（Promega公司），Caspase-3 mRNA及Survivin mRNA引物由上海赛百盛生物技术有限责任公司合成。

1.1.2 实验分组 以50×D/5 000×2×103公式[2]计算出Vit C临床用药量为400 μg/mL。实验分为对照组及40 μg/mL、400 μg/mL、4 mg/mL三种浓度Vit C组。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞置于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，在37oC、5%CO2培养箱中传代培养。每两天换一次液，4 d传代。

1.2.2 细胞增殖测定（CCK-8法） 取指数期A549细胞，待生长至近融合状态，经0.25%EDTA的PBS消化后，配成5 000/mL，然后将细胞以1 000/孔接种于96孔板，置于CO2培养箱培养24 h后加药，在培养箱中继续培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h后，加入10 μL CCK-8混合液，震荡10 s，继续培养2 h后吸出上清液450 nm测OD值，绘制生长曲线。

1.2.3 细胞集落形成测定（克隆形成法） 取对数生长期的A549细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，离心后，把细胞重悬在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。将细胞悬液稀释成500个/mL，以1 000/孔接种于6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37oC、5%CO2培养箱培养1周，当培养皿中出现镜下可见的克隆时，加入以上浓度药物培养1周。终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加适量结晶紫应用染色液染30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，并在显微镜（低倍镜）计数大于20个细胞的克隆数。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率 用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度为1×106/mL接种于10 cm皿中，置于5%CO2、37oC培养箱中培养12 h后，用含0.5%小牛血清的DMEM培养液继续培养24 h，使细胞周期同步化。加入Vit C（400 μg/mL），对照组不加药，分别作用6 h、12 h、24 h、48 h，收集贴壁细胞，制成单细胞悬液，70%乙醇固定，4oC保存过夜，-20oC保存（有效期为1周）。检测前用PBS洗去固定液，加入20 μL RnaseA，37oC孵育30 min后，暗处加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1×105/mL-1×106/mL，采用流式细胞仪检测，激发光源为氩离子，激发波长488 nm，用Multicycle DNA分析软件行细胞周期的测定。

1.2.5 RT-PCR检测Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA的表达水平 取对数生长期A549细胞加入400 μg/mL的Vit C作用6 h、12 h、24 h、48 h后TRIzol一步法提取总RNA，取1 μL总RNA以10 μL体系逆转录，制备cDNA，并稀释30倍备用。Caspase-3 mRNA上游引物：5’-TGACCGAGGC TACATTCAGATGACACC-3’，下游引物：5’-CAAGAGAG TTGGGCTGACCAGAAACAC-3’，扩增产物365 bp；Survivin mRNA上游引物：5’-CCCTTTCTCAAGGACCACC GCATC-3’，下游引物：5’-CACTGAGAACGAGCCAGACT TGGC-3’，扩增产物133 bp；β-actin上游引物：5’-AGTGT GACGTGGACATCCGCA-3’，下游引物：5’-ATCCACAT CTGCTGGAAGGTGGAC-3’，扩增产物243 bp。扩增后取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。应用凝胶成像系统对电泳条带进行扫描分析，计算相对表达水平（与β-actin比值）。

1.2.6 统计分析 所有实验均重复3次，用Mean±SD表示，经SPSS 10.0进行两两比较的t检验，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 细胞增殖情况及生长曲线 以40 μg/mL、400 μg/mL、4 mg/mL三种浓度Vit C干预A549抑制增殖情况见图1，结果表明400 μg/mL Vit C、4mg/mL Vit C明显抑制A549的增殖（P＜0.05），而40 μg/mL Vit C抑制作用不明显（P＞0.05）；随着浓度的增大，3天抑瘤率明显增大，见图2。

2.2 细胞集落形成观察 A549细胞分别加入40 μg/mL Vit C、400 μg/mL Vit C、4 mg/mL Vit C，肉眼克隆见图3A，镜下计数见图3B，400 μg/mL Vit C、4mg/mL Vit C组明显抑制了肺癌A549细胞克隆的形成，与对照组、40 μg/mL Vit C 组相比有统计学差异（P＜0.05）。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡实相结果 图4可见，临床用药量（400 μg/mL）的Vit C随着作用时间的延长，G0/G1期、S期的细胞明显增多，进入G2/M期的细胞明显减少，说明Vit C可以延长A549的细胞周期，从而抑制其增殖，当作用24 h、48 h后G0/G1期、S期的细胞明显增多，并且随着作用时间的延长细胞凋亡数明显增加。

2.4 RT-PCR检测Vit C对Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA水平的影响 取对数生长期A549细胞，加入400 μg/mL的Vit C培养6 h、12 h、24 h、48 h后提取总RNA进行RTPCR，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明Vit C作用6 h后Caspase-3 mRNA的表达增高，随着作用时间的延长表达量无明显增多（P=0.001、0.002、0.002、0.003）；随着Vit C作用时间的延长，Survivin mRNA的表达并未明显变化（P=0.959、0.552、0.23、0.173），见图5。

图 1 不同浓度Vit C作用A549细胞生长曲线对照组 vs Vit C（40 μg/mL）组：P＞0.05；对照组 vs Vit C（400 μg/mL、4 mg/mL）组：P＜0. 05；Vit C（40 μg/mL）组 vs Vit C（400 μg/mL、4 mg/mL）组：P＜0.05。Fig 1 Cell proliferation curve of A549 cell with Vit C at different doses Control group vs Vit C (40 μg/mL) group: P＞0.05;Control group vs Vit C (400 μg/mL, 4 mg/mL) group: P＜0.05;Vit C (40 μg/mL) group vs Vit C (400 μg/mL, 4 mg/mL) group: P＜0.05.

图 2 不同浓度Vit C作用A549瘤生长抑制率（第3天）随着Vit C浓度的增加，对A549第3天的生长抑制率也随着增高。Fig 2 Ratio of inhibition of A549 cell with Vit C at different doses (d3)The ratio of inhibition of A549 cell increased with the increase in the concentration of Vit C.

3 讨论

图 3 不同浓度Vit C作用A549后集落形成数Vit C（400 μg/mL）组、Vit C（4 mg/mL）与对照组及Vit C（40 μg/mL）组比明显抑制A549集落形成（P＜0.05）。Fig 3 Colony of A549 cell with Vit C at different doses Compared with control group and Vit C group, Vit C (400 μg/mL) group and Vit C (4 mg/mL) group inhibited A549 colonies (P＜0.05).

Vit C是具有许多生物学功能的水溶性己糖衍生物，它的分子式是C6H8O6，其分子中2位和3位碳原子的两个烯醇式羟基极易解离，释放出H+。通常情况下，我们普遍认为小剂量Vit C是天然抗氧化剂，通过还原作用清除氧自由基，而大剂量Vit C具有氧化作用[3-4]。而研究也主要集中于Vit C在小剂量时对肿瘤发生的预防作用，对肿瘤的治疗作用的研究还处于初始阶段。本研究发现Vit C在400 μg/mL时即可以明显抑制肺癌A549细胞的增殖（P＜0.05），流式细胞仪检测发现400 μg/mL Vit C可以将A549细胞阻滞在G0/G1期及S期，使进入G2/M期的细胞明显减少，从而延长了细胞周期，并且发现随着作用时间的延长，可以明显促进A549细胞的凋亡。

图 4 400 μg/mL Vit C干预A549细胞不同时间后流式细胞仪检测凋亡和细胞周期变化结果与对照组、6 h、12 h组比较，24 h组、48 h组A549细胞明显被阻滞在G0/G1期和S期，凋亡率明显增加（P＜0.05）。Fig 4 Changes of cell cycle and apoptosis after 400 μg/mL Vit C treated A549 cell different time Compared with control group, 6 h and 12 h groups, 48 h and 24 h groups blocked A549 cells in G0/G1 and S phase, and induced apoptosis markably (P＜0.05).

图 5 400 μg/mL Vit C干预A549细胞不同时间对Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表达的影响Vit C作用6 h后Caspase-3 mRNA的表达增高，随着作用时间的延长表达量无明显增多；随着Vit C作用时间的延长Survivin mRNA的表达未见明显变化。Fig 5 Expression of Caspase-3 mRNA, Survivin mRNA after 400 μg/mL Vit C treated A549 cell different time The relative expression of Caspase-3 mRNA up-regulated when Vit C treated A549 cell 6 hours later and it no longer changced with time prolonged; the relative expression of Survivin mRNA was not significant change after Vit C treated A549 cell.

众所周知，凋亡逃逸是肿瘤发生、发展的重要机制之一。细胞凋亡主要通过线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路启动凋亡。线粒体通路主要是含BH3结构域的Bcl-2家族成员与另外的Bcl-2家族成员（Bax亚家族成员Bax、Bak）等作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C（Cyt C）和其它蛋白[5]，Cyt C在ATPPdATP存在的情况下，Cyt C与凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease activating factor, Apaf-1）形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域（caspase recruitment domain,CARD）募集胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化并启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡[6]；死亡受体通路主要机制是死亡配体与死亡受体激活无活性的pro-caspase-8变为有活性的Caspase-8。激活的Caspase-8不仅可激活下游效应Caspase裂解多种蛋白质而最终导致细胞凋亡，同时还可以降低线粒体内膜电位使Bc1-2家族成员裂解，导致Cyt C的释放[7]，后者可与Apaf-1结合，在dATP的存在下活化Caspase-9，Caspase-9能激活下游效应Caspase-3[8]。而Caspase-3作为这两条通路上的下游共同基因，在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用。本研究发现，随着作用时间的延长Vit C可以上调Caspase-3的表达，提示Vit C可能通过氧化作用进一步减少肿瘤细胞内本来就缺乏的过氧化物酶，并增加过氧化氢（H2O2）的产生[9]从而作用于pro-caspase激活Caspase-3诱导A549细胞凋亡。而作为最强的凋亡抑制基因，Survivin在肿瘤逃逸凋亡过程中有着不可忽视的作用，可直接与Caspase-3、Caspase-7结合并抑制它们的活性[10]而阻止肿瘤细胞凋亡的发生。本研究亦观察了Vit C对Survivin的影响，发现其并不明显下调Survivin mRNA的表达。因此我们认为，Vit C可能虽然未能下调Survivin mRNA的表达，但可能阻止Survivin蛋白与Caspase-3的结合，从而影响肿瘤细胞的凋亡过程。综上所述，我们认为在临床治疗量的Vit C即可以明显抑制肺癌A549的增殖，并将其阻滞在G0/G1期及S期，并且随着作用时间的延长，可以明显诱导肺癌A549的凋亡，其机制可能是通过上调Caspase-3的表达。因此，我们有理由相信Vit C作为肿瘤化疗的辅助用药在临床应用中有广阔的前景。