布鲁氏菌外膜蛋白OMP15.6表达及免疫反应原性测定

王少华，李 娜，吴清民

（中国农业大学农业部人畜共患病重点开放实验室，北京 100193）

布鲁氏菌病是世界范围内引起的人畜共患病重要病原体之一[1]。世界部分地区在20世纪80年代中期后，我国自20世纪90年代后期，布鲁氏菌病疫情一直呈现回升态势，是在持续稳定下降20年后的大幅度反弹。目前国内外尚缺乏高效的布鲁氏菌疫苗。布鲁氏菌细菌学检测在方法上存在安全性差、耗时耗力和诊断通量低等缺点；利用细菌多糖抗原的血清学检查存在交叉反应及不能鉴别临床感染动物和疫苗免疫动物等缺陷，致使动物布病防控技术临床应用受到限制[2]。布鲁氏菌抗原成分复杂，有脂多糖、O多糖、外膜蛋白等，研究发现布鲁氏菌外膜蛋白具有很好的免疫原性[2-3]。为此，本研究试图通过大肠杆菌表达、鉴定蛋白的免疫反应原性，以便为进一步寻找诊断性抗原提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体 羊布鲁氏菌16M灭活菌株及PGEX-4T-2表达载体均由本实验室保存。

1.2 血清与抗体 豚鼠抗布鲁氏菌阳性血清由本实验室置备；羊抗豚鼠IgG购自北京百奥康生物技术有限公司。

1.3 目的片段的PCR扩增和重组表达载体的构建

1.3.1 引物的设计与合成 根据GenBanK中OMP15.6对应的基因设计引物，并引入BamHI和EcoRI酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

上游引物5'CG GGA TCC GCC TATACGCTGACCTTT 3'；下游引物5'CG GAA TTC CGGTCAT TCTTCATCAGG 3'。

1.3.2 基因组模板DNA的提取 取灭活的羊种布鲁氏菌16 M菌液15 μL，用135μLTNE重悬之后加入135μL含 2%Triton X-100TNE洗涤。然后加入新鲜配置的5 mg/mL的溶菌酶30μL，轻弹混匀，37℃水浴30 min。再加入5 mg/mL蛋白酶K 15μL，65℃水浴孵育过夜，最后加入10μg/mL的RNAse，-20℃保存备用。

1.3.3 目的基因的PCR扩增 反应条件为94℃预变性3 min；94℃变性45 s，退火温度从65℃降到55℃，每降一度2个循环，55℃时10个循环，72℃延伸90 s，共36个循环；最后72℃延伸10 min。

1.3.4 重组表达载体的构建 PCR产物BamHI和EcoRI双酶切后，和同样用BamHI和EcoRI双酶切的表达载体PGEX-4T-2连接，将连接产物转化入感受态细胞BL21，在带有氨苄抗性的LB平板上，筛选阳性菌落。将该平板上的单个菌落导入含有氨苄的LB液体中，37℃过夜摇动后，提质粒酶切鉴定，直接以菌液为模板进行PCR鉴定，并送公司测序。

1.4 重组表达载体的诱导表达 将测序正确的阳性菌液导入含有氨苄的2YT液体培养基，37℃培养至菌液的OD590值在0.5-1.0时加入IPTG，IPTG终浓度分别为0.5 mM、1.0 mM、2.0 mM，分 2 h、4 h、6 h 取样，检测蛋白是否表达，并确定最佳表达条件。

1.5 Western－blotting检测表达蛋白的免疫原性 重组的OMP15.6蛋白经12%SDS－PAGE凝胶电泳后，半干转印至硝酸纤维素膜，10%马血清37℃封闭1 h，PBST洗涤3次，与1:500稀释的豚鼠抗布鲁氏菌阳性血清作用70 min，PBST洗涤3次，与1:1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗豚鼠IgG室温作用1 h，PBS洗涤3次。4-氯-1-萘酚显色1-2min后加去离子水终止。

2 结果

2.1 目的片段的PCR扩增 用OMP15.6对应基因的特异引物，以羊种布鲁氏菌16 M的基因组为模板成功扩增出423bp的预期目的片段（图1）。

2.2 重组表达载体构建 将目的片段克隆至表达载体PGEX-4T-2后，提质粒酶切鉴定，结果阳性（图2）。同时测序鉴定，结果表明OMP15.6基因与GenBank中公布的结果一致，读码框也正确，测序及比对结果略。

2.3 重组OMP15.6蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 筛选出的阳性克隆菌在OD值为0.5-1时加入不同浓度的IPTG诱导均有表达，0.5 mM、1.0 mM、2.0 mM的IPTG浓度对表达影响不大，只是随着诱导时间延长，在6 h时表达量较大。本试验构建的是 GST－OMP15.6融合蛋白，GST标签长度约26 kDa，推测目标蛋白大小约为15.6 kDa，因此重组融合蛋白大小约为 41.6 kDa。12%SDSPAGE蛋白电泳，在大约41.6 kDa处可见表达条带，符合目的基因的大小，在空载体中无该条带表达。OD=0.58，IPTG浓度为0.5 mM，各个时间段重组蛋白的表达结果见图3。

2.4 OMP15.6重组蛋白表达产物的Western－blotting鉴定 本试验构建的是GST－OMP15.6融合蛋白。以豚鼠抗布鲁氏菌阳性血清检测重组融合 蛋 白 OMP15.6，Western Blotting结果显示表达的重组蛋白具有良好的免疫反应性（图4）。

3 讨论

本研究克隆了羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP15.6的基因序列，构建了原核表达载体PGEX-4T-2/OMP15.6，经过双酶切鉴定证明目的基因插入了表达载体。经插入片段测序结果显示插入片断与布鲁氏菌OMP15.6基因序列完全一致，读码框架完全吻合，说明羊布鲁氏菌OMP15.6基因的原核表达载体构建成功。在0.5 mM的IPTG，37℃诱导2 h的条件下，PGEX-4T-2/OMP15.6在BL21中就表达出了布鲁氏菌外膜蛋白GST-OMP15.6融合蛋白。通过与布鲁氏菌免疫豚鼠血清反映证明表达获得的融合蛋白具有良好的免疫识别效果。本研究所用的原核表达载体pGEX-4T-2可使目的蛋白与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达，据此可进一步利用亲和层析法大规模纯化获取该蛋白，其间有一凝血酶切割位点，可使目的蛋白容易分离纯化，有效地获得天然蛋白，为进一步研究布鲁氏菌OMP15.6基因的功能和及其编码蛋白的抗原性分析打下了良好的基础。

探讨布鲁氏菌外膜蛋白作为布鲁氏菌病诊断抗原和亚单位疫苗是布鲁氏菌研究工作者近三十年来一直追求的目标[4-7]。国外学者通过外膜蛋白提取鉴定、蛋白质组学技术等方面研究证实布鲁氏菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生坚强的免疫力，可以作为布鲁氏菌病诊断的抗原和布鲁氏菌亚单位疫苗的候选物[4，8]；如果要获得理想的外膜相关蛋白性抗原，需要就其免疫原性、免疫持续期进行测定。本研究将进一步通过蛋白纯化、鉴定，检测布鲁氏菌感染动物体内针对该蛋白的免疫反应规律。

[1]骆利敏，李明，芮勇宇，等.中国布鲁氏菌插入序列基因多态性的研究[J].中国地方病学志，2006，25（1）：42-45.

[2]Salhi I，Boigegrain R A，Machold J，et al.Characterization of new members of the group 3 outer membrane protein family of Brucella spp[J].Infect Immun，2003，71（8）：4326-4332.

[3]Cloeckaert A，Vizaino N，Paquet J Y.Major outer membrane protein of Brucella spp：past，present and future[J].Vet Microbiol，2002，90：229-248.

[4]Cassataro J，Pasquevich KA，et al.A recombinant subunit vaccine based on the insertion of 27 amino acids from OMP31 to the N-terminus of BLS induced a similar degree of protection against B.ovis than Rev.1 vaccination[J].Vaccine，2007，25（22）：4437-4446.

[5]Cloeckaert A，Zygmunt M S，et al.Purification and antigenic analysis of the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella abortus[J].Res Microbiol，1996，147（4）：225-235.

[6] Lindler LE， Hadfield TL， et al.Cloning of a Brucella melitensis group 3 antigen gene encoding OMP28，a protein recognized by the humoral immune response during human brucellosis[J].Infect Immun，1996，64（7）：2490-2499.

[7]Winter A J and Rowe G E.Comparative immune responses to native cell envelope antigens and the hot sodium dodecyl sulfate insoluble fraction（PG） of Brucella abortus in cattle and mice[J].Vet Immunol Immunopathol，1988，18（2）：149-163.

[8] Cassataro J， Estein S M， et al.Vaccination with the recombinant Brucella outer membrane protein 31 or a derived 27-amino-acid synthetic peptide elicits a CD4+T helper 1 response that protects against Brucella melitensis infection[J].Infect Immun，2005，73（12）：8079-8088.