淫羊藿苷对人外周血内皮祖细胞增殖功能的影响

杜海斌马 华* 武丽萍申 静宫建芳

淫羊藿苷对人外周血内皮祖细胞增殖功能的影响

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目的 淫羊藿苷对体外培养的人外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响。方法 采用密度梯度离心法分离获得人外周血单个核细胞，用添加VEGF、FGF的M199培养液培养7d后，经激光共聚焦显微镜、流式细胞仪鉴定为EPCs。用不同浓度药物干预培养EPCs，分别作用不同时间（24、48、72h）后，倒置相差显微镜下观察EPCs生长情况，四唑蓝比色试验（MTT法）测定EPCs的吸光度值。用西药西辛伐他汀作为对照组。结果 与对照组比较，淫羊藿苷高、中、低浓度组均改善了EPCs增殖功能（P＜0.05），且呈一定的量效、时效关系，在中浓度最为显著（P＜0.05）能明显促进增殖能力；在同一浓度组中，随时间延长淫羊藿苷对EPCs的促进作用逐渐增强，于72h达到高峰，且中药中剂量组对EPCs的促进作用优于西药组辛伐他汀组。结论 淫羊藿苷能促进EPCs增殖，从而刺激缺血组织血管新生和再生，可能是其防治心脑血管及周围血管疾病的机制之一。

淫羊藿苷；内皮祖细胞；增殖

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类能分化为血管内皮细胞的干细胞，是内皮细胞的前体细胞，亦称为血管母细胞，其表面标志性抗原为CD34+。内皮祖细胞主要存在于骨髓、脐血

和外周血中。EPCs功能主要体现在其能在一定条件下，在机体缺血区、组织损伤部位形成新生血管，促进血流恢复和创伤修复[1,2]。本研究通过观察淫羊藿苷对人外周血内皮祖细胞体外增殖及功能的调控作用，及其可能的量效、时效关系，旨在探讨淫羊藿苷可能的内皮保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

淫羊藿苷药物：淫羊藿苷，又名淫阳藿黄酮苷，分子式C33H40O15。由中国药品生物制品检定所提供；辛伐他汀纯品（由Sigma公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分离、培养

采取健康成人志愿者空腹外周血，每人40mL，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液、PBS、添加VEGF、FGF的M199培养液，分离培养贴壁细胞。

表1 淫羊藿苷与对照组EPCs 增殖比较（χ—±s）

1.2.2 EPCs细胞表型鉴定

①激光共聚焦显微镜观察收集的贴壁细胞。②流式细胞仪分析检测。

1.2.3 MTT法检测EPCs活性

取培养7d的EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化后收集，制成细胞悬液，以1×104/mL细胞密度接种，每孔100μL接种于96孔培养板，37℃ 5%CO2孵箱培养24h后，按照ICA药液浓度将培养板分4个实验组，每组设6个复孔和空白对照：分别为辛伐他汀组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，5%CO2孵箱37℃分别培养24、48、72h后，每孔加20μL MTT试剂培养，4h后弃上清，再加入二甲基亚砜每孔100μL，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪于波长490nm处测吸收度（OD）值。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件。计量资料以χ—±s表示，组间资料比较采用ANOVA，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EPCs的鉴定及CD34、CD133的表达

用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I对EPCs染色后，通过激光共聚焦显微镜鉴定，流式细胞仪示贴壁细胞表达CD34阳性率为（56.91±3.84）%，CD133阳性率为（23.68±0.99）%。

2.2 不同浓度淫羊藿苷对人外周血EPCs增殖的影响

MTT法检测结果显示(表1)，淫羊藿苷显著增加EPCs 的增殖能力，EPCs 分别与不同浓度淫羊藿苷培养 24、48、72h 后测得，3种浓度淫羊藿苷在同一作用时间内均可使 EPCs 吸光度值（OD）增高，与对照组比较，均有显著差异（P＜0.05，差异有统计学意义）。中浓度淫羊藿苷组OD值增加明显（P＜0.05，差异有统计学意义）。同一浓度淫羊藿苷作用24、48、72h 3种时间内，OD值随时间推移逐渐增高，EPCs的增殖能力在淫羊藿苷刺激后48h开始明显改善，于72h达到高峰（P＜0.05，差异有统计学意义），西药组在3d作用时间内随时间的推移，OD值逐渐增高，同一作用时间，测得的OD值高于低、高剂量浓度淫羊藿苷组，但低于中浓度剂量组，低、中浓度剂量的淫羊藿苷与西药组辛伐他汀比较有统计学意义，高浓度淫羊藿苷组与辛伐他汀组无统计学比较意义。

3 讨 论

2005年版药典[3]规定以叶片中淫羊藿苷、总黄酮含量分别不得低于0.5%、5%为内在质量标准。中药淫羊藿《本草》曰：补腰膝，强心力，坚筋骨，益精气。“肾主骨生髓”，只有肾中经气充盈，才能充盈骨髓，EPCs来源于骨髓，因而可以推测补肾活血对于EPCs具有动员作用。

过去人们认为成人血管仅由血管新生来维持及修复，1997年Asahara等[5]首次分离并证实人类出生后的外周循环血液中，存在能分化成为血管内皮细胞的血管EPCs，循环EPCs的发现证实出生后血管生成的存在。EPC不仅参与生理性血管形成，在多种病理状态下也能被动员出骨髓而增强代偿性血管重建。动员的或移植的自体来源的内皮祖细胞，为血管内皮损伤或内皮功能障碍及血管再生性相关疾病的治疗提供了新的靶点。

目前，随着对内皮祖细胞研究的进一步深入，中医药对内皮祖细胞干预的研究也已展开。但总体来说尚处于起步阶段，文献[6-9]报道葛根素、银杏叶提取物、白藜芦醇、丹参、黄芪注射液均可促进外周血EPCs 增殖，并能改善外周血EPCs 的黏附、迁移能力。中药淫羊藿苷对内皮祖细胞干预的研究目前尚少，国内学者[4,5]研究表明，淫羊藿苷有降低心肌耗氧量、增加冠脉流量的作用，能抑制缺氧引起的血管内皮细胞的减少。丁玲等[10]研究发现，中药单体淫羊藿苷 (ICA)能有效促进小鼠ES细胞分化为心肌细胞，而EPCs是内皮细胞的前体细胞，EPCs数量增加和功能的良好发挥对于内皮损伤后的修复及经皮腔内冠状动脉成形术术后再狭窄的防治具有重要的作用。本试验以辛伐他汀作为对照，来探讨淫羊藿组对于体外培养稳定生长的EPCs的数量的影响，从而为寻找理想的改善损伤内皮的药物开辟了道路，也为中西医结合切入点寻找理论依据。

本实验采用四唑蓝比色法（MTT法）检测到不同浓度的淫羊藿苷能显著促进EPCs的增殖，且中浓度剂量组增殖优于降脂西药辛伐他汀，并呈一定的量效、时效关系。提示淫羊藿苷通过动员自体EPCs增殖达到治疗心脑血管疾病的目的，从细胞水平证实了该药防治心脑血管及周围血管疾病的可能作用机制，为相关疾病的治疗提供了新的途径。在实验中还观察到中浓度的淫羊藿苷组较其他浓度组对EPCs增殖效果显著，高浓度的淫羊藿苷对细胞增殖较中浓度组具有一定的减弱作用，这与中药的双向调节效应相吻合，其具体机制目前尚不完全清楚，有待进一步的研究。以这些研究为基础，有望研制开发一些具有临床应用价值的药物，将骨髓内皮祖细胞动员到受损部位，为防治心脑血管疾病提供一种新的策略。

[1] 宋显晶,刘斌,杨萍,等.辛伐他汀对体外培养人脐静脉血内皮祖细胞扩增及黏附能力的影响[D].吉林大学硕士论文,2007.

[2] Gao SQ,FU DX,ZHANG HM.Advances in the study on thetreatment of osteoporosis with epimedium brevicornumand its compound prescription[J].Chin J Chin Material Med,1999,4(4):249-251.

[3] 郑筱萸.中国药典[M].北京:化学工业出版社,2000:267-268.

[4] 吉瑞瑞,李付英,张雪静,等.淫羊藿苷对缺氧诱导血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中国中西医结合杂志,2005,25(6):525-530.

[5] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et a1.Isolation of putative progenitorendothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.

[6] 肖刚峰,张怀勤,黄晓燕,等.丹参的两种主要成分对培养内皮祖细胞药理作用研究[J].中医药学刊,2006,24 (6):1035-1037.

[7] 肖刚峰,张怀勤,季亢挺,等.丹参素对体外培养内皮祖细胞数量和功能的影响[J].华西药学杂志,2006,21(3):232 -234.

[8] 张芙荣,陈君柱,朱军,等.葛根素对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响[J].中国中药杂志,2004,29(8):777-781.

[9] 顾俊,王长谦,范华骅,等.白藜芦醇对于外周血内皮祖细胞体外增殖分化的影响[J].微循环学杂志,2006,16 (3):7-10.

[10] 丁玲,楼宜嘉. 淫羊藿苷促进小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的相关机制研究[D].浙江大学博士学位论文,2007.

Effects of Icariine on Quantity and Fuction of Peripheral Blood-derived Endothelial Progenitor Cells

DU Hai-bin1, MA Hua2, WU LI-ping3, SHEN Jing1, GONG Jian-fang1
(1 Department of Chinese and Western Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
2 Department of Chinese Traditional Medicine, The Second Af fi liated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
3 Shanxi Provincial Institute of Chinese Medicine, Taiyuan 030012, China)

Objective To investigate the effects of Icariine on proliferation of endothelial progenitor cells (EPCs) derived from peripheral bloodderived. Methods The mononuclear cells were isolated from human peripheral blood by density gradient centrifugation. The laser scanning confocal microscope and the flow cytometry (FCM ) was used to determine the EPCs of human peripheral blood. The activity of EPCs was observed under reverse microscope.MTT method was used to determine the OD value of EPCs. Result Compared with control group, the Icariine decoction contained serum high, medium, low dose group increased the proliferative adility of EPCs, showing a time-and do se-effect relation. The Icariine decoction medium dosage group had the most prominent effect on proliferation(P＜0.05). Among the same Icariine decoction dosage group, The effect increased as time went by and reached peak at 72 h. Conclusion Icariine decoction drug-containing serum can premote proliferation of the endothelial progenitor cells, stimulate angiogenesis and regeneration of ischemic tissue .The results may be parts of the mechanisms of Icariine decoction to prevent and treat cardio-/cerebrovascular and peripheral vascular disease.

Icariine; Endothelial progenitor cells; Proliferation

R329.2

B

1671-8194（2010）10-0011-03

1 山西医科大学2007级中西医结合临床专业硕士研究生（030001）

2 山西医科大学第二附属医院中医科（030001）

3 山西省中医研究所（030012）

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mahua1022@yahoo.com.cn