肺腺癌组织中IGF-IR表达与患者临床病理因素及预后的相关性

张雪艳 冯久贤 沙惠芳 黄进肃 韩宝惠

近年来，肺癌发病率不断升高，而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%。其中肺腺癌是NSCLC最主要的组织类型之一，其发病率不断升高，因而，对肺腺癌的细胞起源及癌变机制的研究受到国内外学者的高度关注。胰岛素样生长因子I受体（insulin-like growth factor I receptor, IGF-IR）是多种生长因子调控枢纽，在细胞生长、分化过程中起重要调节作用。越来越多的资料表明，IGF-IR在肿瘤组织中存在不同程度的异常表达，并在肿瘤细胞分化分裂、增殖凋亡中扮演重要角色。本研究旨在探讨IGF-IR在肺腺癌中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集上海交通大学附属胸科医院1999年1月-2004年6月经外科根治性手术切除且随访资料完整的126例肺腺癌患者纳入本研究。患者年龄22岁-80岁，中位年龄57岁；男性65例，女性61例。按国际抗癌联盟（International Union Against Cancer, UICC）标准进行分期，Ib期30例，II期39例，IIIa期57例。高分化30例，中分化76例，低分化20例。随访从手术之日开始，末次随访日为2009年12月15日，本组患者的随访时间均＞5年。所有患者术前均未进行过放疗或化疗，术后接受2次-4次以铂类为主的化疗。手术标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm厚切片。由两位病理科主任、副主任对原发病灶的病理切片进行审核，明确病理诊断。

1.2 免疫组化检测IGF-IR表达 免疫组化技术采用Supervision法，肺腺癌患者癌旁的正常肺组织作为阴性对照。具体操作步骤如下：石蜡切片60oC，烘片1 h-2 h；二甲苯脱蜡3次，每次20 min，梯度乙醇水化后蒸馏水冲洗3次；PBS冲洗，5 min×3次；二甲苯脱蜡后，用柠檬酸缓冲液pH 6.0（上海长岛生物技术有限公司）进行高温高压抗原修复，修复时间120 s；用PBS冲洗3次，每次3 min-5 min；切片滴加兔抗人IGF-IR单克隆抗体（DA-KO公司）50 μL，于4oC环境过夜；用PBS冲洗3次，每次3 min-5 min；滴加50 μL第二抗体Supervision（上海长岛生物技术有限公司）（按试剂盒使用），室温下孵育40 min；用PBS冲洗3次，每次3 min-5 min；每张切片滴两滴约100 μL的DAB显色液，显微镜下观察3 min-5 min；苏木精染色5 min，冲洗20 min；1%盐酸酒精分化，冲洗20 min；切片经95%、100%乙醇各两档脱水，放入电热恒温鼓风干燥箱风干；二甲苯透明，中性树脂封固。

1.3 免疫组化评定标准 免疫组化结果由两位病理科主任、副主任对切片进行审核。IGF-IR表达主要以细胞膜及胞质混合型表达为主，阳性染色呈棕黄色颗粒。评定用半定量方法：总的评定分数根据染色阳性细胞数的比率和染色强度。染色阳性细胞定量：＜5%为0分，5%-25%为1分，26%-50%为2分，＞50%为3分；染色强度：无染色为0分，染黄色为1分，染棕色为2分。最终的表达评定分数为：染色细胞定量分数×染色强度分数，分别为0分-1分为阴性（-），2分-3分为弱阳性（+），4分-6分为阳性（++）。

1.4 统计分析 实验数据应用SPSS 11.0统计软件进行分析处理。组间率的比较采用χ2检验。Kaplan-Meier方法计算生存曲线，用Log-rank进行差异检验。生存分析采用Cox单因素及多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGF-IR在肺腺癌组织中的表达 IGF-IR主要以细胞膜及胞质混合型表达为主，阳性染色呈棕黄色颗粒（图1）；126例患者中89例表达阳性，其中18例（++），71例为（+）。阳性率为70.63%。

2.2 IGF-IR表达与临床病理特征的关系 IGF-IR表达与肺腺癌患者肿块大小及T分期相关，与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分化、病理分期及CEA等指标无关（P＞0.05）（表1）。

2.3 IGF-IR表达与转移和疗效的关系 126例患者中，95例发生转移，其中69例为IGF-IR阳性表达。85例患者可随访到转移后化疗疗效。IGF-IR表达与否与是否转移、转移途径、转移部位及转移后化疗疗效均无统计学差异（表2）。

2.4 IGF-IR表达与肺腺癌患者生存期的相关性 进一步分析IGF-IR和肺腺癌患者生存期的相关性，用Log-rank进行分析，结果表明，126例肺腺癌患者中，IGF-IR表达情况对生存期的影响无统计学差异。生存曲线趋势也表明，IGF-IR表达对患者生存无明显的影响（图2）。

2.5 肺腺癌患者生存期影响因素的Cox回归模型分析 Cox比例风险回归模型对影响患者预后的多项因素进行单因素分析表明：年龄、病理分期、N分期、CEA、是否转移、转移后化疗疗效均影响患者的生存。进行多因素分析显示，是否转移、转移后化疗疗效均是影响生存期的独立因素。无转移的患者较有转移的患者生存期长（P＜0.001），相对危险度为0.005（95%CI:0.001-0.043）。此外，转移后化疗效果好的患者比化疗效果不佳的患者预后好（P＜0.001），相对危险度为1.969（95%CI: 1.423-2.726）（表3）。

3 讨论

IGF-IR是一种酪氨酸蛋白受体，它的主要作用是介导IGF-I和IGF-II的促生长活性。当配体与IGF-IR的亚单位中的结合部位结合后，激活位于胞内的酪氨酸激酶，引起胞内信号转导，进一步引起细胞分裂分化和组织器官的生长发育。细胞的正常增殖分化和机体的正常发育均受IGF-IR介导的各信号传导途径的调节，当IGF-IR介导的信号传导失常时，机体可能形成肿瘤。IGF-IR在肿瘤的发生发展过程中起着多方面的作用，如促进细胞向恶性表型转化、促进肿瘤细胞生长和分裂增殖、抑制肿瘤细胞凋亡并与肿瘤的浸润有密切关系。研究发现IGF-IR在肺癌、肝癌、前列腺癌中呈过度表达。

表 1 IGF-IR表达与肺腺癌临床病理特征的相关性Tab 1 Correlation between IGF-IR expression and clinicopathological factors in 126 patients with lung adenocarcinoma

图1 IGF-IR在肺腺癌组织中呈不同程度表达（免疫过氧化物酶染色，×200）。A：IGF-IR表达（++）；B：IGF-IR表达（+）；C：IGF-IR表达（-）。Fig 1 Immunohistochemical staining of IGF-IR protein in lung adenocarcinoma tissues (immunoperoxidase stain, ×200). A： strong staining in the most of the lung adenocarcinoma cells (++)； B： weak-moderate staining in lung adenocarcinoma cells (+)； C： negative staining in lung adenocarcinoma cells (-).

表 2 IGF-1R表达与肺腺癌患者的转移及疗效的相关性Tab 2 Correlation between IGF-1R expression and metastasis and chemotherapy efficacy in 126 patients with lung adenocarcinoma

图2 IGF-IR表达与肺腺癌生存期的关系（Logrank=0.08, P=0.775）Fig 2 Cumulative Kaplan-Meier survival curves for patients with IGF-IR (Log-rank=0.08,P=0.775)

表 3 肺腺癌患者生存期影响因素的Cox回归模型分析结果Tab 3 Univariate and multivariate analysis of clinicopathological factors for the overall survival rate of 126 patients with lung adenocarcinoma

本研究发现，IGF-IR表达与患者肿块大小和T分期相关，病灶大及T分期晚的患者IGF-IR表达增高。其可能的机制为：IGF-IR既可以结合IGF-I，又与IGF-II具有很强的亲和力，在IGF信息传导通路中发挥重要作用。正常情况下，细胞表面的IGF-IR对细胞凋亡无明显的影响。细胞癌变时，各种癌基因和抑癌基因的突变及相互作用而致肿瘤细胞中IGF-IR基因表达异常。表达IGF-IR的肿瘤细胞通过合成和分泌内生性IGFs，借助IGFs/IGF-IR环路刺激肿瘤细胞无限增殖，并维持其恶性表型。IGF-IR的过度表达可以阻止肺癌等肿瘤细胞的凋亡，且与肿瘤的浸润性生长、转移关系密切。在实验研究中发现，通过抗IGF-IR抗体、IGF-I类似物或反义RNA使IGF-IR功能失活或数目减少，均可导致相应肿瘤细胞系大批凋亡，阻止体外增殖，并使其在同源动物或裸鼠体内的致瘤性丧失，可见，IGF-IR在建立和维持肺肿瘤转化表型中扮演着重要角色，可以成为抑制细胞增殖的合适靶点。

本研究也发现，IGF-IR表达与患者肿块大小和T分期相关，而与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分化、病理分期、远道转移及CEA等指标均无关，且与是否转移、转移途径、转移部位及转移后化疗疗效均无关。生存曲线趋势也表明，IGF-IR表达对患者生存无明显的影响。因此，IGF-IR可能并非有效的预测肺腺癌疗效及预后的标志。近年研究[1,2]发现，IGF-IR在乳腺癌中表达与疾病进展及放疗耐药相关，且预示不良预后。对IGF-IR表达与临床指标及预后的关系，各家报道不一致，目前仍有争论。有关前列腺癌和乳腺癌的研究[3,4]显示，早期肿瘤和正常组织中IGF-IR表达增多，而进展性癌表达减少。IGF-IR表达提示预后良好，而在软组织肉瘤的研究中也支持这一观点[5]。而也有相反的观点认为，IGF-IR揭示不良的预后[6,7]。对肺癌的研究较少，Merrick等[8]的研究表明，IGF-IR在肺腺癌中表达高于其它组织类型，有统计学意义，且与不良预后有关。而Lee等[9]对71例I期NSCLC的研究表明，IGF-IR表达与临床指标（如性别、组织类型、分期、分化等）无相关性，且和患者预后无相关。而最近Ludovini等[10]研究发现VEGF和IGF-IR共表达的患者预后不良，而单独IGF-IR表达和预后无关。最近的一项研究[11]通过对189例NSCLC的手术标本进行检测IGF-IR，发现IGF-IR表达与EGFR表达具有相关性，且IGF-IR蛋白表达与肺癌患者分期有关，但与肺癌患者的生存无关。因此，目前对IGF-IR对肺癌患者预后及临床指标关系的观点说法不一，本研究显示，IGF-IR表达与肺腺癌转移及预后等无关。

Cox单因素和多因素分析表明：年龄、病理分期、N分期、CEA、转移及转移后化疗疗效均是患者生存期的影响因素。高龄患者易进展，这可能与老年患者心肺功能相对较差，以及对手术的耐受性不如年轻患者好等因素有关；CEA也与病情进展有关，而多因素分析表明，是否发生转移及转移后疗效均是影响生存期的独立因素。患者出现转移后，依据转移部位，临床医生所选择的治疗方法不同，包括化疗、放疗、再次手术等。而且转移的部位不同，化疗方案也不尽相同，如DP、D、Meccnu+VM26、GP、TP等。由于方案种类较多，且每种病例数较少，故未进行化疗方案与预后关系的分析。共有85例可随访至有化疗疗效，分析疗效与预后的关系发现二线化疗疗效为预后的独立影响因素，而IGF-IR并非影响患者预后的独立因素。因此，IGF-IR与肿瘤的形成、侵袭、肿瘤细胞增殖等相关，可能成为抑制细胞增殖的作用靶点，但并不适合作为预测疗效及预后的适合指标。