植物PPDK基因在基因工程中的应用

王原媛，白云凤，张定宇

（1.山西农业大学研究生学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院作物遗传研究所，山西太原030031；3.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

1 PPDK基因的结构及其功能

在植物的C4代谢途径和景天酸代谢途径（Crassulacean acid metabolism，CAM）中存在一种叫作丙酮酸磷酸双激酶（Pyruvateorthophosphate dikinase，PPDK）的限速酶。PPDK基因大部分位于植物的叶肉细胞中催化丙酮酸（Pyruvate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）。在细菌、原生动物等生物体中也均发现有PPDK酶存在，在这些生物体中PPDK起丙酮酸激酶的作用，催化丙酮酸和ATP生成的反应。原生动物、细菌与植物的一级结构十分相似，这种一级结构上的高度同源性说明在原核生物及真核生物分化之前，原始的PPDK基因就已经出现了（表 1）。

表1 原生动物、细菌与植物中PPDK基因的区别

在植物体内，丙酮酸磷酸二激酶首先以一个 大的前体蛋白形式在细胞质中被合成，并在叶绿体中加工为成熟的酶。PPDK基因的cDNA序列最先是由Matsuoka等人从玉米中克隆出来的，然后根据cDNA序列预测其氨基酸序列，这也是完整的PPDK蛋白一级结构的最早研究。玉米cDNA序列中包含有一个长2 844 bp的开放读码框，其分子量是编码为947个氨基酸的多肽。

Matsuoka等人通过确定纯化酶的N端氨基酸序列，结果表明，成熟的酶含有876个氨基酸残基，转运肽含有71个氨基酸残基，从而确定了转运肽的剪切。将PPDK酶的转运肽与其他核基因编码的叶绿体蛋白进行比较，结果显示，PPDK转运肽与1，5－二磷酸核酮糖酶小亚基及捕光复合体AB的转运肽有3个区域较为相似，N端的氨基酸序列MAASV类似N端同源区MAXSX，中间序列TSFARRSV与小麦同源区II SSFAGKAV类似，第三段序列SGAGRGQHC与玉米1，5－二磷酸核酮糖小亚基转运肽剪切位点附近序列SNGGRIRC类似。这些序列都位于各自肽链的相同位置，不过，PPDK转运肽的长度比其他酶的转运肽要长得多。

2 PPDK基因在C4循环和C3植物中的研究

2.1 C4循环中的PPDK基因

在植物体内的C4代谢途径，植物以及PPDK的具体作用是催化一个可逆的三步反应，将ATP，Pi和丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。反应的第一步是将ATP的γ-磷酸及β-磷酸转移到酶活性位点的组氨酸残基上，第二步是将γ-磷酸转移至磷酸，第三步将剩余的β-磷酸转移到丙酮酸。总反应式如下:

丙酮酸＋腺嘌呤 -P-Pβ-Pγ+Pi→PEPβ+AMP+PPiγ+2H+

从PPDK蛋白的晶体结构中可以看出，其催化反应可能是在一个蛋白结构域中（包含通过核苷酸及丙酮酸结合结构域间的铰链区盘曲折叠而成的活性位点）进行的。

C4循环途径较C3途径具有更大的优势，其能在外界CO2浓度较低的情况下，通过它的酶系统（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）、NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）、NADP-苹果酸酶（NADP-ME）和丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）等[2]）保持高效的CO2同化率。其中，PPDK是C4植物光合反应中的一个叶绿体酶，同时是C4途径的专一性酶，该酶催化CO2初级受体——磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的生成。该催化反应主要受到光的调控，是C4光合作用途径的限速步骤之一。在C4植物的叶片中，丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）主要位于叶绿体的叶肉细胞气孔中，C4植物在高光强和高温的条件下，比C3植物具有更强的光合效率，在C4途径中，由于CO2在维管束鞘细胞中浓缩，氧化（oxylase）受到抑制或者停止，以至于光呼吸可以忽略。

2.2 PPDK基因在C4途径的酶分子生物学中的研究

随着C3植物中C4途径存在的证实及分子生物学手段的运用，人们更深刻地了解C4途径酶类的分子机理及它们在C3植物体内的表达。Agarie等认为，PPDK在一种两栖类植物荸荠（Eleocharis）体内表达的研究是近年来研究最为成功的例子。在陆生环境下，荸荠进行C4循环途径，但在水生环境下，荸荠进行C3方式的循环途径。通过研究丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）的同源（分别为陆生和水生环境下）基因PPDK 1和PPDK2，证明了尽管基因PPDK1和PPDK2同源性很高，但却不完全相同。PPDK1和PPDK2分别编码一个叶绿体PPDK和一个细胞质PPDK。原因在于PPDK1蛋白是由cDNA的核序列编码，且包含一个特殊的N端区域，可能作为叶绿体的转移肽，然而PPDK2缺乏这个特殊区域。核DNA编码的PPDK基因，其细胞专一性表达是在转录水平上调控的，PPDK1和PPDK2从2个不同的起始点转录。在2个不同的起动子的控制下，大的转录产物是叶绿体PPDK，包括转运肽；小的产物是细胞质PPDK。基因组的Southern印迹结果表明，在荸荠的基因组中存在小的PPDK基因家族。基因组的Northern印迹结果表明，荸荠的叶绿体PPDK1和细胞质PPDK2都是在其空心秆（荸荠的光合器官）中表达，但是这些基因的表达随着荸荠处于生态环境条件的不同而不同。当荸荠在陆生环境中时，其空心秆具有Kranz结构并以C4循环途径进行光合作用；当荸荠在水生环境中时，其空心秆以C3循环途径进行光合作用。

2.3 C3植物中的PPDK基因

C3植物中是否存在C4光合途径一直受到很多科研人员的关注，在C4植物叶片中有特殊的Kranz结构。有研究显示，C4植物是从C3植物中分化出来的，而且这种转变在进化上是多源的。Sheen认为，C4型PPDK基因在C3植物中可能有一个祖先，含有一个类似于C4型基因的结构，通过引入第一外显子——一个编码非常重要的转入叶绿体的转运肽而成为C4基因。但是目前已经发现，在水稻等C3植物中的PPDK基因与C4型的PPDK基因一样，也具有2个不同的启动子转录的不同起始位点。在水生植物Hydrilla verticilata[3]和 Egeria densa[4]中没有 Kranz 结构，但是却存在C4光合途径的运行，说明在植物叶片的单一光合细胞中可以进行C4光合微循环。早有报道，在 C3作物大豆[5]、小麦[6]、水稻[7]叶片中有 C4光合酶系统，由于酶活性较低，因此提出C3植物叶片中可能具有有限的C4光合途径。Chen等[8]研究指出，向C3植物菠菜中外加C4光合原初产物OAA或MA，可提高叶片的光合能力，这为在C3植物中建立C4微循环系统以提高光合效率的可能性提供了依据[9]。

Aoyagi等证实，在C3植物中存在着与C4植物同样的丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）。已有报道，C3植物中的PPDK与C4植物中的PPDK具有相同的酶学特征，如被光激活、对冷胁迫的敏感，催化性质等。Hata以及Aoyagi等证明，PPDK不但存在于叶绿体中，而且还存在于小麦种子的细胞质中，Imaizumi通过Northern blot分析发现，在水稻种子的细胞质中有PPDK的存在。PPDK大部分位于叶肉细胞，它的活性已在C3植物的光合组织中被测定。Hata等发现，C3植物水稻幼苗体内的PPDK与C4植物玉米的PPDK无论在蛋白分子量，还是抗原决定簇和蛋白质结构等方面都相同。

3 PPDK基因在植物基因工程领域的应用

3.1 转基因烟草植株中PPDK基因与铝胁迫的关系

将C3植物冰叶日中花（M crystallinum）的PPDK基因转入烟草的基因组中，转基因的烟草就能通过根部有机酸的分泌来抵抗铝的胁迫。在高等植物的细胞质和叶绿体中，PPDK基因的表达水平受干旱和盐胁迫的影响。通过在转录水平对patatin基因家族B33启动子的调控，生产出表达冰叶日中花PPDK或者ΔPPDK的转基因烟草植物并发现它们可以改善铝的胁迫。在转基因植株中，当受到铝胁迫时根的生长加强；然而在野生的植株中根的生长却被强烈地抑制。通过ECR染色和原子吸收光谱测定，在转基因植株根尖铝的含量要比野生植株含量低。此外，转基因植株所产生的三羧酸循环中间产物（柠檬酸和苹果酸）要比野生植株高。通过对ECR根染色、有机酸分泌和铝积累的研究发现，2种转基因植物相比，含有PPDK基因的植株比表达ΔPPDK基因的植株对铝胁迫有更强的耐受力[10]。

3.2 PPDK转基因水稻的研究进展

随着科学技术特别是分子生物学方面的发展，目前已成功将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）、NADP-苹果酸酶（NADP-ME）转到水稻中获得了5种转基因水稻。Schreiber等[11]将已导入玉米C4光合关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、丙酮酸磷酸 二 激 酶 （PPDK）、NADP- 苹 果 酸 酶（NADP-ME）和PEPC+PPDK的转基因水稻为材料，以其受体品种Kitaake（WT）为对照，对C4转基因水稻秧苗叶片气孔与叶鞘维管束的结构特征进行研究，结果表明，品系叶片上的气孔密度最高，其气孔总面积（是对照的1.47倍）在转基因品系中也是最高，转基因PPDK品系水稻秧苗干质量明显高于对照品种，其叶片的类囊体结构也比对照品种更完整、有序，有利于光能转换，但是其叶鞘维管束组织却不如对照发达。综合以上结论，PPDK仍然具有转基因水稻高光效表达的结构基础。季本华等[9]利用亚硫酸氢钠对转PEPC基因水稻叶片进行喷施，发现其净光合速率的增加幅度较大。

3.3 PPDK转基因籼稻IR64的研究进展

在具有增加20倍光合作用酶活性的转基因水稻中，C4基因对C3植物水稻的生理冲击是很小的，没有观察到水稻光合作用特征的改变。张建福等研究的玉米高光效基因PPDK在籼稻IR64中的整合及其与光合作用相关的特性分析表明，丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）的反应是逆向的，依赖于底物、活化剂和非活化剂的浓度。这可能是丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）的过量表达不能导致转基因水稻叶片碳代谢显著效应的原因。尽管是初步的结论，但丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）的过量表达可以增加每丛转基因水稻植株的粒数和千粒质量。对转基因IR64植株的分析结果表明，转基因IR64植株剑叶的全氮含量比非转基因IR64植株高，说明玉米丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因能够促进转基因IR64植株对土壤中氮的吸收和同化，而且在温室条件下，大部分转基因IR64植株的结实率和收获指数高于非转基因植株[12]。

3.4 大豆中PPDK基因的研究进展

Li等[5]研究大豆叶片C4循环途径酶表明，不同发育时期大豆叶片内均存在PPDK酶作为C4途径的再生磷酸烯醇式丙酮酸的特定酶PPDK，其变化趋势是从苗期到初荚期酶活性逐渐升高，然后降低。在初荚期，PPDK酶活性均达到最高值。

4 展望

目前，已经明确了植物PPDK基因是C4植物的限速酶之一，对植物光合效率的提高有至关重要的作用，而且已经成功运用植物基因工程将C4植物的PPDK基因导入C3植物中，但PPDK基因的许多优势作用目前尚未明确，所以，运用包括分子生物学在内的各种方法，研究PPDK对光合作用、植物抗性等的具体影响方式，并将其优势功能运用于其他农作物，将会成为今后一个重要的研究方向。

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