利用生物条形码技术对蓖麻毒素进行微量检测

冯玉奎，张立营，孙 宇，孙英姿

蓖麻毒素（ricin toxin，RT）是一种从蓖麻种子中提取的植物糖蛋白，蓖麻毒素具有很强的毒性作用，对成人的平均致死量为1.5 μg。蓖麻种植广泛，蓖麻籽中蓖麻毒素含量高且易于提取，国外已有报道恐怖分子用蓖麻毒素作为恐怖袭击的手段。因此，无论是从国际生物武器核查角度，还是从防护目的，开展对蓖麻毒素的检测研究都具有十分重要的现实意义[1-3]。

美国西北大学Mirkin领导的课题组于2003年首次报道了生物条形码检测技术 （bio-bar codes assay，BCA）[4]。生物条形码检测技术的优点有：①检测灵敏度高，比常规的ELISA方法高出六个数量级（100万倍）；②操作程序简单；③针对不同的目标蛋白设计不同长度和序列的条形码DNA，可分析复杂样本中的多个目标蛋白；④具有较高的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高特异性；⑤检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势[5-10]。

本实验应用蓖麻毒素多抗和单抗建立了蓖麻毒素的生物条形码检测体系，旨为发展高灵敏度的蓖麻毒素检测试剂盒鉴定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 蓖麻毒素、蓖麻毒素多抗、单抗由军事医学科学院微生物流行病研究所赠送，胶体金购自Sigma公司，银染试剂购自sigma公司，磁性微球购自invitrogen公司，检测使用的玻片购自TEL公司。1.2 NP探针的制备及鉴定

1.2.1 DNA合成 按文献[3]设计合成下列寡核苷酸链，由上海生工公司合成。互补 probe NP链：5'-TACGAGTTGAGACCGTTAA GACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGA10-（CH2）6-SH-3'；条形码DNA链：5'-CGCATTCAGGATTGCATGATT GCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3'；

捕获 DNA 链：5'-HS-（CH2）6-A10-TACGAGTTGAGA CCGTTAAGACGA-3'；NP标签链：5'-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCG A10-（CH2）6-SH-3'。

1.2.2 多抗标记胶体金 分别取1 ml的胶体金和100 μg的蓖麻毒素多抗，用0.1 mol/L K2CO3调节pH至9.0。在搅拌下将胶体金和抗体混合，10 min后再加入5%BSA，使其最终浓度为1%。

1.2.3 胶体金标记蛋白的纯化 胶体金标记蛋白先低速离心20 min，弃凝聚的金胶粒。然后13 000×g离心1 h。去除上清，沉淀物用0.01 mol/L，pH7.6 PBS混悬至原量。平衡过夜后，同上重复离心2次。最后用含 1%BSA的 PBS（含 0.02%NaN3）将沉淀物重悬为原体积的1/10，4℃保存。

1.2.4 互补probe NP链修饰胶体金 将互补probe NP链（终浓度为2 μmol/L）加入多抗修饰的胶体金中，静置 40 h，再以 PBS调整 pH至 7.0，增强 NaCl浓度至 0.1 mol/L，10 000×g离心 10 min得到含寡核苷酸的胶体金。

1.2.5 barcode DNA与互补 probe NP链杂交 将barcode DNA（终浓度为 2 μmol/L）加入上面经修饰的胶体金中，室温杂交4 h，10 000×g离心，得到NP探针。

1.3 MMP探针的制备及鉴定 MMP探针的制备包括磁性微球的激活和单抗的标记，具体过程参考其产品说明书。

1.4 检测探针的制备 将NP标签链 （终浓度为2 μmol/L）加入胶体金中，静置 40 h，再用 PBS 调整pH 至 7.0，增强 NaCl浓度至 0.1 mol/L，10 000×g 离心10 min得到含寡核苷酸的胶体金，即为检测探针。

1.5 生物条形码检测过程

1.5.1 三明治结构的形成 将50 μl MMP探针（5 mg/ml）加入10 μl已知浓度的蓖麻毒素溶液中，37℃下剧烈震荡1 h。加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的蓖麻毒素及其它不相关的蛋白。加入NP探针50μl，剧烈震荡30 min，形成三明治结构。接着加上磁场，用磁铁固定MMPs探针，用100 μl PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。

1.5.2 条形码DNA的获取 形成三明治结构后，接着加上磁场，再用磁铁固定MMPs探针（三明治结构）的同时，用100 μl PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。加入50 μl超纯水到三明治结构中，60℃剧烈震荡30 min，使条形码DNA去杂交。三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA，用于定性定量检测。

1.5.3 条形码DNA的常规PCR检测 将获得的条形码DNA进行常规的PCR扩增，扩增产物进行2%的凝胶电泳，EB染色观察结果。

1.5.4 条形码DNA的芯片检测 取10 μl条形码DNA 与 85 μl 0.6 mol/L PBS 和 5 μl检测探针混合，加到玻片的捕获DNA链处，42℃反应2 h，0.01 mol/L的PBS洗脱，接着将银染液A液1 ml和B液1 ml混匀，加在芯片的捕获DNA链处，静置10 min，平板扫描仪记录结果。

图 1 胶体金-多抗复合物的TEM结果（×75 000）

2 结果

2.1 胶体金-多抗复合物的透射电镜（TEM）和UV－vis鉴定 用支持膜的镍网蘸取胶体金-多抗复合物，滴加磷钨酸复染处理，直接在透射电镜下观察，胶体金颗粒周围有明显的灰黑色晕环（图1），表明颗粒表面吸附有多抗蛋白。

纳米金-BTV多抗以0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L PBS为空白对照，扫描范围为400～700 nm，以5 nm为扫描精度。最大吸收峰在530 nm处，最大吸光度为1.126。

2.2 NP探针的TEM鉴定和UV－vis鉴定 用支持膜的镍网蘸取NP探针，滴加磷钨酸复染处理，直接在TEM放大观察，胶体金颗粒周围有明显的灰黑色晕环（图2），表明颗粒表面吸附有多抗蛋白。

图 2 NP探针的透射电镜结果（×75 000）

NP 探针以 0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L PBS 为空白对照，扫描范围为400～700 nm，以5 nm为扫描精度。最大吸收峰在530 nm处，最大吸光度为0.968。

2.3 MMP探针鉴定结果 分光光度计检测其标记前后的OD值，利用下面公式检测标记效率：[(A280pre-coupling solution×D)-(A280post-coupling solution)×D)] ×100%/(A280pre-coupling solution×D)=0.603-0.12/0.603=0.784=78%≥60%，符合要求。

2.4 银染时间的优化 银染时间过短过长都不利于结果的观察，笔者对染色时间进行了优化实验。分别在染色后 5、6、7、8、9 和 10 min 用蒸馏水终止反应，进行扫描。结果显示反应后0~8.5 min为检测点灰度明显增加阶段，8 min后检测点灰度增加缓慢，而背景迅速加深（图3），因此染色时间8 min时具有较好信噪比。

图 3 染色时间对结果的影响

2.5 Cut-off值的确定 计算20个阴性结果的平均值和标准差，以平均值加上3倍的标准差作为本实验中判定阳性样本的Cut-off值。如果待测样本的灰度值大于Cut-off值，则判为阳性，反之为阴性。经计算，本实验的Cut-off值为110。

2.6 条形码DNA的检测

2.6.1 条形码DNA的PCR检测结果 去杂交获得的条形码DNA通过常规的PCR进行鉴定，鉴定结果见图4。

M：标志物；1～11蓖麻毒素的浓度依次为10、1 ng/ml，100、10 和 1 pg/ml，100、10、1 fg/ml，100 ag/ml，0 μg/ml图 4 条形码DNA的PCR检测结果

PCR鉴定结果显示检测灵敏度可达1 fg/ml，约是常规ELISA的106倍。

2.6.2 条形码DNA芯片检测结果 去杂交获得的条形码DNA通过芯片进行鉴定，鉴定结果见图5。

1～11 蓖麻毒素的浓度依次为 10、1 ng/ml，100、10 和 1 pg/ml，100、10 和 1 fg/ml，100 ag/ml，0 μg/ml图 5 条形码DNA芯片检测结果

利用ARRAY vision软件对各点的灰度值定量， 依次为 330.5、317.4、313.1、280.6、243.6、199.6、157.2、128.6、115.9、95.1、89.6；芯片鉴定结果显示检测灵敏度可达1 fg/ml，约是常规ELISA的106倍。

3 讨论

现阶段根据蓖麻毒素具有的理化特性、生化特性和免疫原性发展出多种检测法，其中以免疫检测法为主。免疫检测法多是依赖于抗原抗体反应的免疫学方法，包括多克隆和（或）单克隆抗体为基础的放射免疫法或酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫层析试验和电化学发光生物传感器，其中ELISA法是国际规定的检测蓖麻毒素的金标准。检测灵敏度最高只能达到1 ng，存在着灵敏度不高等问题，已经不能满足检验对灵敏度的要求[11-16]。

尽管对于核酸的超灵敏检测已成为常规手段，但对于蛋白质仍存在困难。一个主要的原因是缺乏像PCR那样的直接扩增技术。Mirkin发明的生物条形码技术的突出特点是具有极高的敏感度，本实验利用生物条形码检测技术对蓖麻毒素进行了初步检测，检测结果显示检测灵敏度可达1 fg/ml，为现行任何一种免疫定量方法所不及[5]。本研究为制备高灵敏度的蓖麻毒素生物条形码检测试剂盒奠定了基础。

生物条形码检测技术的优点是具有极高的检测灵敏度，这使得它在一些不能建立核酸检测体系的微量物质检测，如蛋白、肽、氨基酸、激素、类固醇、细胞因子、肿瘤标记物、生物战剂、毒素等物质的检测中有着广泛的应用前景[17-21]。

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