小尾寒羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究

赵春林 ，吴 润 ，李发弟 ，柳纪省 ，王 川 ，王 芳

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州 730046；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；3.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

小尾寒羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究

赵春林1，2，吴 润1，2，李发弟3，柳纪省1，王 川2，王 芳2

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州 730046；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；3.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

为研究小尾寒羊PRNP等位基因密码子多态性，本研究以绵羊全血基因组DNA为模版，通过PCR，扩增绵羊PRNP等位基因目的片段，并将其克隆于pMD-18T载体。经SSCP法筛选出阳性克隆后测序，确定各绵羊PRNP 136位、154位和171位密码子等位基因型及频率分布。在104只绵羊中共检出15个PRNP 136位、154位和171位密码子等位基因型，痒病易感基因型占优势(53.85%，56/104）。本研究证明，该绵羊群属于痒病易感/易发群体，一旦痒病传入具有罹患痒病的极大可能性。

绵羊；PRNP等位基因；136，154和171位密码子；多态性；PCR-SSCP

绵羊PRNP基因型多态性研究已经证实136，154和171密码子与绵羊痒病的易感性/抗性存在极相关性。中国绵羊群体虽以痒病易感性基因型为主[1-3]，但尚未实施绵羊抗痒病育种计划，具有痒病传入感染和发生的极大隐患。目前，国内进行绵羊PRNP密码子136、154和171多态性研究多局限于单倍型分析，等位基因多态性及其基因型频率分布调查却很少[1]。因此，用简便可行且成本低廉的方法来分析绵羊PRNP等位基因多态性和基因型频率分布，对抗痒病育种计划实施具有重要意义。本研究以在甘肃省永昌羊场随机采集的104只小尾寒羊为研究对象，用PCR-SSCP技术进行该绵羊群体PRNP等位基因密码子136、154和171多态性研究，探明其等位基因型种类及其频率分布，对该绵羊群体的痒病易感性做出评估，为建立绵羊PRNP等位基因型快速检测和分型方法提供实验材料和实验技术，并为抗痒病育种工作提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 血样及试剂 从甘肃省永昌羊场随机抽取104只健康小尾寒羊，分别采取颈静脉血液样品，按1∶5加入ACD抗凝，分装并保存于-70℃。全血基因组DNA提取试剂盒、PremixTaq酶、限制性内切酶、pMD18-T载体等购自宝生物工程(大连）有限公司；琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 引物的设计与合成 参照绵羊朊蛋白基因序列，用Primer Premier 5.0在绵羊PRNP完整开放阅读框(ORF）内针对包含136、154和171密码子的片段设计引物。引物设计参照文献[4]，预计可扩增PRNP开放阅读框+360～+627位约为268 bp的目的DNA片段。

1.3 PRNP等位基因DNA片段的PCR扩增和电泳以基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μL，其中 PremixTaq25.0 μL、绵羊基因组 DNA 1.0 μL(50 pmol/L）、上下游引物各 1.0 μL(10 pmol/L）、ddH2O 22.0 μL。离心混匀后置PCR扩增仪中，94℃预变性 5 min；94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 45 s，共35个循环；72℃延伸8 min。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶检测。

1.4 绵羊PRNP等位基因纯合子、杂合子的SSCP分析 2.0 μL PCR扩增产物与8.0 μL变性上样缓冲液离心混匀后，于98℃变性10 min，立即置于冰浴中10 min后上样，在文献[4]的条件下进行扩增产物的SSCP分析。电泳后进行银染，观察带型并判定PRNP等位基因纯合子或杂合子绵羊个体。

1.5 绵羊PRNP等位基因的克隆及其筛选与鉴定将目的DNA片段克隆于pMD-18T载体后进行等位基因克隆的筛选及鉴定。对于纯合子绵羊个体，在一个平板上挑选3个形态一致的无色透明菌落，杂合子挑选10个菌落。提取重组质粒DNA，经PCR扩增和双酶切鉴定后在相同条件下进行基因组扩增产物和质粒扩增产物的SSCP分析鉴定，挑选1个(纯合子）或1对(杂合子）等位基因阳性克隆。PRNP密码子136、154和171等位基因型经测序判定后分析其基因型频率，评估该绵羊群体痒病易感性。检测除绵羊PRNP 136、154和171外其它已知或未知密码子突变，并分析其规律。

2 结果与讨论

2.1 绵羊PRNP等位基因SSCP分析及其隆鉴定在104只绵羊的基因组DNA扩增产物SSCP分析中，依条带数共出现4条、3条和2条条带的3类带型；呈现4或3条带的绵羊为杂合子个体，出现2条带者为纯合子个体。预选阳性克隆重组质粒DNA扩增产物在琼脂糖凝胶中均出现一条大于250 bp的条带，与预期目的片段大小基本符合；琼脂糖凝胶电泳检测阳性重组质粒的双酶切产物，均在250 bp～500 bp之间和大于2 000 bp位置各有一条条带，与预期目的片段、载体片段大小基本相符；应用PCR-SSCP技术成功地鉴定并挑选出104只绵羊PRNP等位基因的阳性克隆。

2.2 阳性克隆测序结果比对及其基因型判定、变异位点分析 104只绵羊的PRNP等位基因密码子136、154和171纯合子基因型占 62.5%(65/104）、杂合子基因型占37.5%(39/104）。其中痒病易感基因型ARQ/ARQ 36.54%(38/104）、ARQ/ARH 10.58%(11/104）、VRQ/ARQ 4.81%(5/104）、ARH/ARH 1.92%(2/104），共计53.85%(56/104）；痒病半抗性基因型ARR/ARQ 11.54%(12/104）、ARR/ARH 0.96%(1/104），共计 12.50%(13/104）；痒病抗性基因型ARR/ARR 22.12%(23/104）；未知与痒病关系的基因型 AHR/ARQ 0.96%(1/104）、ARK/ARQ 3.85%(4/104）、 ARK/ARH 1.92% (2/104）， TRQ/TRQ、TRQ/ARR、TRQ/ARQ、ARQ/ARP和 ARK/ARK各0.96%(1/104），共计11.54%(12/104）。该群体绵羊痒病易感基因型占绝对优势，具有痒病感染或发生的高度易感性，具有罹患输入性痒病的极大可能性，再次证明我国绵羊存在痒病高危群体[1-2，5-6]。研究还发现了国内相关研究已发现的极低频率的ARK/ARK和ARK/ARH基因型[5-6]，其与痒病的关系至今尚不明了。目前国内绵羊PRNP等位基因研究中已发现密码子136均为A/A型[5-6]，而本次研究在5只绵羊中发现了A136V、3只绵羊中发现了A136T突变；国内绵羊中已发现R154H和Q171R/K/H突变及单倍型ARH[1-2，5-6]，而本研究仅发现1只绵羊有R154H突变、36只绵羊有Q171R突变、7只绵羊有Q171K突变、16只绵羊有Q171H突变。AHR、AHQ、VRQ和TRQ单倍型在国内尚为首次发现，其频率很低(＜0.96%）(图1）。

注绵羊群体PRNP的121位～209位的片段中，除密码子136、154和171外另发现18个其他突变位点，其中L141F、R167G、N176Y和Q189L为已发现突变位点，Y131N、L133P、G134R、E149V、M157T、 Y158H、 N162P、 Y166D、 F178S/L、C182S、E199V/L、N200I、F201S、M209T 为新发现的14个突变位点。L141F和Q189L在国内外已有发现，而R167G和N176Y突变在国内未见报道[1-2，5-6]。以上这些突变的意义不详，还需今后进一步探究。本研究发现4例ARQ(141F）、2例ARK(141F）和2例ARH(141F），这与141F突变经常发生在ARQ单倍型并很可能与该单倍型相关联的结论[7-9]相类似。另外，在33例中检出Q189L突变，其中21例为ARQ(189L）等位基因型；发现8例L141F突变，6例见于ARQ/ARQ基因型，2例存在于ARK/ARQ基因型；发现9例R167G突变，7例出现于ARQ/ARQ基因型。可见，在该绵羊群体中141F、167G和189L突变多发生于ARQ等位基因型中，可能与ARQ相关联，对此还需进一步证实。

[1]Zhang L,Li N,Fan B,et al.PRNP polymorphisms in Chinese ovine,caprine and bovine breeds[J].Anim Genet,2004,35(6）:457-461.

[2]Li Y M,Tian B.Chinese little-fat-tail sheep prion protein gene belongs to PrPARH genotype[J].ShengWu HuaXue Yu Sheng Wu WuLi XueBao(Shanghai）,2002,34(1）:62-66.

[3]吴润，谢庆阁，刘湘涛，等.羊朊蛋白(PrPC）基因的克隆和序列分析[J].畜牧兽医学报，2005，36(8）：794-799.

[4]赵春林，王川，吴润，等.绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化[J].中国兽医科学，2008，38(8）：721-727.

[5]Lan Z,Wang Z L,Liu Y,et al.Prion protein gene(PRNP）polymorphisms in Xinjiang local sheep breeds in China[J].Arch Virol,2006,151(10）:2095-2101.

[6]兰邹然，中国地方绵羊品种PRNP基因研究[D].青岛：中国海洋大学，2006.

[7]Moum T,Olsaker I,Hopp P,et al.Polymorphisms at codons 141 and 154 in the ovine prion protein gene are associated with scrapie Nor98 cases[J].J Gen Virol,2005,86(1）:231-235.

[8]Bossers A,Schreuder B E C,Muileman I H,et al.PrP genotype contributes to determining survival times of sheep with natural scrapie[J].J Gen Virol,1996,77(10）:2669-2673.

[9]Saunders G C,Cawthraw S,Mountjoy S J,et al.PrP genotypes of atypical scrapie cases in Great Britain[J].J Gen Virol,2006,87(11）:3141-3149.

Polymorphisms of PRNP Alleles in small tail Han sheep

ZHAO Chun-lin1,2,WU Run1,2,LI Fa-di3,LIU Ji-xing1,WANG Chuan2,WANG Fang2

(1.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China;2.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China）

The PRNP allelic fragments in Small Tail Han Sheep were amplified by PCR with specific primers and cloned into pMD-18T vector.Positive clones were confirmed by enzymatic digestion,SSCP and sequenced.Fifteen genotypes of PRNP allele at codon 136,154 and 171 were detected.The high scrapie susceptibility genotypes observed in this breed was 53.85%.The results showed this flock was a high risk population of the scrapie susceptibility/outbreaks.

sheep;PRNP allele;codons 136,154 and 171;polymorphism;PCR-SSCP

S852.2

A

1008-0589(2010）01-0074-03

2008-12-08

高等学校博士学科点专项科研基金项目(20060733006）；甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2005-11及GNSW-2007-04）；家畜疫病病原生物学国家重点实验室基金项目(2008-2009）

赵春林(1982-），男，甘肃天水人，博士研究生，从事动物病原微生物分子生物学及其致病机理研究.

*通信作者：E-mail：wurun@gsau.edu.cn

赵晓岩）