麦芪益肺合剂对哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影响及安全性研究

2010-09-10 05:13陈培丽王申东毕铭阳胡斯刘家应上海市儿童医院呼吸内科上海市00040上海市儿童医院药剂科上海市00040上海市儿童医院检验科上海市00040
中国药房 2010年39期
关键词:哮喘病儿童医院合剂

陈培丽,王申东,毕铭阳,胡斯,刘家应(1.上海市儿童医院呼吸内科,上海市 00040;.上海市儿童医院药剂科,上海市 00040;.上海市儿童医院检验科,上海市 00040)

麦芪益肺合剂对哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影响及安全性研究

陈培丽1*,王申东2,毕铭阳2,胡斯2,刘家应3(1.上海市儿童医院呼吸内科,上海市 200040;2.上海市儿童医院药剂科,上海市 200040;3.上海市儿童医院检验科,上海市 200040)

目的:通过观察麦芪益肺合剂对系统性呼吸道变态反应性模型小鼠外周血T淋巴细胞的变化,探讨其对辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2(Th1/Th2)平衡的影响及安全性。方法:1%卵蛋白(OVA)刺激复制哮喘模型小鼠,随机分为正常、哮喘模型和麦芪益肺合剂组,采用流式细胞仪测定小鼠外周血(摘除眼球取血)细胞内白细胞介素4(IL-4)及干扰素(IFN-γ)的表达。按最大给药量对小鼠灌胃,对照组给予等量生理盐水,观察小鼠症状及体质量改变。结果:模型小鼠表现出明显非特异性炎症反应征象,而麦芪益肺合剂组小鼠无明显炎症反应征象。与正常组比较,哮喘模型组小鼠IL-4明显升高(P<0.01);与哮喘模型组比较,麦芪益肺合剂组小鼠Th1细胞表达明显增强(P<0.01)。以最大给药剂量灌胃,麦芪益肺合剂组与正常组小鼠症状及体质量无明显改变(P>0.05)。结果:麦芪益肺合剂对小鼠系统性呼吸道变态反应性模型在激发期有干预作用,调节Th1/Th2平恒是其药效作用机制之一。

麦芪益肺合剂;辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2;小鼠;哮喘;安全性

支气管哮喘是儿童呼吸道疾病中的常见病、多发病,已成为全球性的社会卫生问题,对儿童的健康构成了严重威胁。其发病率呈逐年上升趋势,用于哮喘病的费用也逐步增加,误工、误学、心理障碍及生活质量降低所造成的无形损失更是无法计算。在西医对哮喘病的治疗尚无“治本”措施的今天,中医中药“扶正固本”的治疗方法无疑是调节患儿机体免疫能力的重要手段。本研究通过观察系统性呼吸道变态反应性模型小鼠白细胞介素4(IL-4)及干扰素(IFN-γ)细胞因子的表达状况,研究上海市儿童医院自制“麦芪益肺合剂”对哮喘Th1/Th2细胞失衡的调节作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

单激光四色流式细胞仪(美国BD公司);Turbo BOY N型雾化器(德国Pari公司)。

1.2 试药

麦芪益肺合剂(主要成分:黄芪、麦冬、党参、防风、五味子、乌梅、陈皮、甘草、白术、茯苓等)由上海市儿童医院自制(批号:05090403,含量:8.32 g(生药)·mL-1);1%卵蛋白(OVA,上海伯澳生物科技公司,批号:070301);细胞因子(抗IFN-γFITC、IL-4假单孢外毒素(PE))、细胞表面标记抗体(CD3PC5、CD8ECD)均购自美国Beckman Coulter公司;离子霉素、莫能霉素、佛波酯(PMA)等均购自美国Sigma公司。

1.3 动物

健康8周龄Balb/c小鼠18只,♀♂兼半,体质量(21.02±1.46)g,由复旦大学动物实验中心提供(动物生产许可证号:SCXK(苏)2002-0031)。

2 方法

2.1 系统性呼吸道变态反应性哮喘鼠模型的复制

小鼠致敏方法参照Mccusker C等[1]文献报道,即实验第0、7、14天分别ip 1%OVA抗原混悬液0.2 mL,第28天起用1%OVA超声雾化吸入,每天20 min,连续7 d。。

2.2 分组及给药

实验分为3组,即正常(等容生理盐水)、哮喘模型(等容生理盐水)、麦芪益肺合剂(0.8 mL)组。ig给药,每天1次,致敏前给药。

2.3 流式细胞术检测方法

用流式细胞仪检测小鼠外周血(摘除眼球取血)IL-4及IFN-γ,应用双管标记检测法,即采用CD4、CD8和IFN-γ FITC三色标记一管,用于检测TH1细胞,CD4、CD8和IL-4 PE三色标记一管,用于检测TH2细胞。具体方法:采血1 mL,肝素锂抗凝,分A试管(标记测定)加入5 μL PMA、10 μL离子霉素和2 μL莫能霉素,B试管(阴性对照)加2 μL莫能霉素。37℃、5%CO2培养箱孵育4 h。分别加入10 μL CD3PC5、CD8ECD,室温避光孵育15 min,固定,破膜。细胞内抗IL-4及IFN-γ单抗标记,流式细胞术检测,以IFN-γ FITC和IL-4 PE建立双参数直方图,对所确定的CD3+淋巴细胞进行分析,得出Th1(CD3+/IFN-γ(+)和Th2(CD3+/IL-4+)的百分率。

2.4 肺组织标本的采集

小鼠处死后,剥离肺脏,浸泡在10%甲醛溶液中固定24 h,HE染色,置光镜下检查。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 病理学观察

正常组小鼠气管、肺泡及间隔形态结构正常,未见充血,未见细胞增生;哮喘模型组小鼠小血管和细支气管管壁增厚,细胞浸润,组织水肿;麦芪益肺合剂组小鼠小血管和细支气管管壁轻度增厚,少量细胞浸润。病理学切片见图1。

图1 病理学切片A.哮喘模型组;B.麦芪益肺合剂组;C.正常组Fig 1 Pathological sectionA.asthma model group;B.Maiqi yifei mixture group;C.normal group

3.2 各组IFN-γ及IL-4细胞因子的变化

与正常组比较,哮喘模型组CD4 IL-4显著增高(P<0.01);与哮喘模型组比较,麦芪益肺合剂组CD4 IL-4显著降低(P<0.01)。与正常组比较,哮喘模型组CD4 IFN-γ无显著变化(P>0.05);与哮喘模型组比较,麦芪益肺合剂组CD4 IFN-γ显著升高(P<0.01)。各组IFN-γ及IL-4细胞因子的变化见表1。

表1 各组IFN-γ及IL-4细胞因子的变化Tab 1 Change of IFN-γ and IL-4 in each group

4 讨论

近年的流行病学调查研究显示,儿童哮喘的发病率呈逐年升高的趋势,1990年全国0~14岁儿童哮喘发病率为0.19%,2000年上升至1.50%,10年前后患病率上升了64.84%[2]。2006年的资料显示,上海6~14岁学龄期儿童哮喘的患病率已经达到5.92%,比6年前又增加了1.77倍。现代医学研究已证实,气道变应性炎症是引起哮喘病的基本病理改变和主要发病机制,涉及机体免疫功能和神经调节功能,消除气道的慢性炎症及降低机体的致敏状态应贯穿整个治疗过程中。近年来制定的全球哮喘防治创议(GINA)中和各国制定的哮喘病防治方案中,均规定了抗气道炎症是哮喘病的主要治疗原则。但目前以吸入糖皮质激素为主的局部抗炎治疗并不能改善哮喘患儿的特应性素质,因此我国中医中药针对哮喘缓解期的“扶正固本”治疗理念备受关注,可用中西医的优势互补提高哮喘病疗效和改善哮喘病患儿的预后。

本院自制麦芪益肺合剂是在传统“玉屏风散”、“生脉饮”“四君子汤”方基础上综合而成,由黄芪、麦冬、党参、防风、五味子、乌梅、陈皮、甘草等10味药组成。黄芪、党参大补肺脾元气,固表实卫;麦冬养阴生津,气阴二补;肺虽主气,其气却来源于后天水谷之气,欲补肺气,当先补脾,故配白术、甘草、五味子以抗组胺、抗白三烯D4、抑制肥大细胞脱颗粒;黄芪可促进IL-2的产生,上调Th1细胞因子;乌梅有抗蛋白过敏作用;防风多糖Xc-2有增强机体免疫功能;麦冬皂苷及麦冬多糖可增加小鼠胸腺、脾脏质量,激活小鼠网状内皮系统的吞噬功能;黄芪、茯苓、甘草可诱生IFN-γ[1]。

多项研究显示,哮喘患者Th1/Th2比值较正常人低,而Th2类细胞因子的表达优势是导致慢性气道炎症和气道高反应的根本原因,因此纠正Th1/Th2比值失衡有利于哮喘的治疗。Mossman TR[2]根据Th细胞分泌细胞因子的不同将其分为2个功能亚群,即Th1、Th2。Th1细胞有合成分泌IFN-γ及IL-2的功能,它可作用于迟发型超敏反应和抑制过度的Th2反应,从而降低E型免疫球蛋白应答。Th2细胞有合成分泌IL-4的功能,而IL-4在促进B淋巴细胞合成IgE、促发过敏反应中起了很大作用。IL-4测定结果表明,哮喘模型组高于治疗组及正常组,表明其对Th1/Th2细胞的平衡具有积极的调节作用,可对细胞内IFN-γ表达有促进作用,有利于哮喘症状的改善和长期稳定。从小鼠肺部病理改变观察,麦芪益肺合剂对呼吸道非特异性炎症是有疗效的,通过干预,可减轻气道高反应。

目前中药制剂的应用困境之一为有效成分的定量定性。本院已成功测定该合剂主要成分之一黄芪甲苷的含量,也完成了防风、甘草、陈皮的定性反应,发现不同批号麦芪益肺合剂的黄芪甲苷含量存在一定差异,提示原材料的采购选择应固定产地。

[1]Mccusker C,Chicoine M,Hamind Q,et al.Site-specific sensitization in a murine model of allergic rhinitis:role of the upper airway in lower airways disease[J].J Allergy Clin Immunol,2002,110:891.

[2]Mossman TR,Coffman RL.Heterogeneity of cytokine secretion patterns and fuctions of helper T cells[J].Adv Immunol,1989,46:111.

Effect of Maiqi Yifei Mixture on the Balance of Th1/Th2 in Mice withAsthma and Its Safety Study

CHEN Pei-li(Dept.of Respiratory Medicine,Shanghai Children’s Hospital,Shanghai 200040,China)

WANG Shen-dong,BI Ming-yang,HU Si(Dept.of Pharmacy,Shanghai Children’s Hospital,Shanghai 200040,China)

LIU Jia-ying(Dept.of Clinical Laboratory,Shanghai Children’s Hospital,Shanghai 200040,China)

OBJECTIVE:To investigate the influence of Maiqi yifei mixture on the balance of Th1/Th2 and its safety by observing the changes of T lymphocytes in peripheral blood of mice with respiratory allergy.METHODS:The asthma mice model was induced by 1%OVA,and model mice were randomized into normal groups,asthma model group and Maiqi yifei mixture group.The expressions of IL-4 and IFN-γ in peripheral blood cells were determined by flow cytometer.Mice were given maximal dose of drugs via i.g.gtt.Control group

same quantity of normal saline.The change of symptoms and body weight of mice were observed.RESULTS:Model group showed significant non-specific inflammation reaction symptoms,while Maiqi yifei mixture group hadn’t significant inflammation reaction symptoms.The expression of Th1 in mice of Maiqi yifei mixture group was higher than in asthma model group(P<0.01).The IL-4 level in mice of model group was higher than in normal group(P<0.01).After giving maximal dosage,the symptom and body weight of mice had no significant difference(P>0.05).CONCLUSION:Maiqi yifei mixture can prevent respiratory allergy of mice in the stimulated period.One of its mechanisms is regulating the balance of Th1/Th2.

Maiqi yifei mixture;Th1/Th2;Mice;Asthma;Safety

R285;R97

A

1001-0408(2010)39-3669-03

2010-07-17

2010-07-26)

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