黄芩苷、黄芩素抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的研究Δ

谢林利，周 密，陈勇川，熊丽蓉，夏培元（第三军医大学西南医院药剂科，重庆市 400038）

黄芩苷、黄芩素抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的研究Δ

谢林利＊，周 密，陈勇川#，熊丽蓉，夏培元（第三军医大学西南医院药剂科，重庆市 400038）

目的：研究黄芩苷、黄芩素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响。方法：选用铜绿假单胞菌X140为研究对象，用32 μg·mL-1的黄芩苷、2 μg·mL-1的黄芩素干预X140生物膜的培养。以阿奇霉素为对照，采用倍比稀释法对生物膜内活菌菌落计数。扫描电子显微镜（SEM）观察不同培养条件下生物膜的变化。结果：32 μg·mL-1的黄芩苷、2 μg·mL-1的黄芩素可以显著抑制铜绿假单胞菌的黏附性和抑制生物膜的形成（P＜0.01）。结论：黄芩苷、黄芩素可抑制细菌生物膜的形成，影响铜绿假单胞菌的黏附性。

生物膜；黄芩苷；黄芩素；铜绿假单胞菌

Δ国家自然科学基金资助项目（30400598）

＊药师。研究方向：细菌耐药。电话：023-68754404。E-mail：xie.l.l@163.com

#通讯作者：副主任药师，硕士。研究方向：中药药理及临床药理学。电话：023-68765495。 E-mail：zwmcyc@163.com

黄芩的抗菌有效成分为黄酮类化合物，主要包括黄芩苷（Baicalin）、黄芩素（Baicalein）等。笔者前期研究表明，黄芩苷、黄芩素联合苯唑西林对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）有显著的协同抗菌作用，通过抑制MRSA产生PBP2a逆转对苯唑西林的高度耐药[1]。黄芩水煎液对铜绿假单胞菌生物膜也具有清除作用。属假单胞菌属的铜绿假单胞菌是慢性呼吸道感染常见的致病菌，生成生物膜后具备较高的耐药能力和可播散的特点，主要表现为对抗菌药物产生渗透障碍、不敏感及特殊生理状态，在院内获得性感染中检出率最高，引起的生物膜感染是目前医疗器械相关感染的主要原因[2]。本研究目的在于确证黄芩苷、黄芩素对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用，为临床有效治疗细菌生物膜感染提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SN3400NⅡ型扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）；LRH-150-B型智能生化培养箱（广东省医疗器械厂）；MR23i型高速冷冻离心机（法国Jouan公司）；BL600型电子分析天平（德国Sartorius公司）；MIP-P型多点接种仪（日本Sakuma公司）；移液器（芬兰Finnpipette公司）。

1.2 试药

黄芩苷、黄芩素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为375756、465119）；阿奇霉素（东北制药集团公司沈阳第一制药厂，批号：081213014）；酵母提取物、胰蛋白胨（上海生物工程有限公司，批号分别为0701B02、218-171214PBAC-T）；戊二醛、无水乙醇和氯化钠为分析纯。

1.3 菌株

实验菌株：铜绿假单胞菌X140（分离自第三军医大学西南医院临床标本）；质控菌株：ATCC 27853（中国药品生物制品检定所）。

2 方法

2.1 抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用琼脂平皿二倍稀释法测定阿奇霉素、黄芩苷、黄芩素的MIC[1]。质量控制采用美国临床和实验室标准协会CLSI（2006）推荐标准执行。

2.2 细菌生物膜的鉴定、观察

按文献方法[3]复制生物膜的体外模型，采用SEM观察生物膜形成情况。将LB琼脂平板转实验菌株铜绿假单胞菌X140过夜。即挑单菌落接种于10 mL LB肉汤中，37℃下恒温振荡培养过夜，收集菌液以10 000 r·min-1离心10 min，调整细菌数约为5×108cfu·mL-1，将菌液1 mL、LB肉汤4 mL加入6孔板，同时加入已消毒处理的盖玻片，37℃恒温培养。于24 h取出盖玻片，经无菌生理盐水冲洗去掉浮游菌，用pH7.4的PBS漂洗3次后用2.5%戊二醛固定，再依次用50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，每次均为10 min，待乙醇挥发后，真空条件下镀金粉，在电压15.0 kV、6 000倍放大倍数下观察有无细菌黏附，此后每24 h更换LB肉汤，直至观察生物膜形成。

2.3 黄芩苷、黄芩素、阿奇霉素对铜绿假单胞菌黏附情况及生物膜形成的观察

实验设空白对照、黄芩苷、黄芩素和阿奇霉素组，每组4份标本。在制备生物膜的同时加入实验设计浓度的黄芩苷、黄芩素和阿奇霉素，37℃培养，每日更换含药LB肉汤，培养7 d，每组取3份标本以连续稀释法计数细菌菌落。另每组取1份按上述方法以SEM观察铜绿单胞菌生物膜形成情况。

2.4 黄芩苷、黄芩素对早期和成熟生物膜的作用观察

实验设空白对照、阿奇霉素、黄芩苷和黄芩素组，于LB肉汤中37℃恒温培养，每日更换LB肉汤。采用连续稀释法进行细菌菌落计数，并按上述方法以SEM观察。

2.5 统计学方法

结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析处理。

3 结果

3.1 阿奇霉素、黄芩苷、黄芩素对铜绿假单胞菌X140的MIC

阿奇霉素、黄芩苷、黄芩素对铜绿假单胞菌X140的MIC见表1（表中PAE140代表铜绿假单孢菌X140）。

表1 阿奇霉素、黄芩苷、黄芩素对铜绿假单胞菌X140的MICTab 1 MIC of azithromycin，baicalin and baicalein against pseudomonas aeruginosa X140

3.2 生物膜载体表面的活菌计数结果

对空白对照、黄芩苷、黄芩素和阿奇霉素组载体表面的活菌计数结果分别为（209.7±10.02）×104、（122.0±11.27）×104、（117.7±6.66）×104、（119.3±6.66）×104cfu·mL-1。实验组比空白对照组显著减少（P＜0.01），而实验组之间则没有明显差异（P＞0.05）。

3.3 SEM观察结果

通过SEM观察可见，培养3 d后早期生物膜形成，载体表面有大量的铜绿假单胞菌黏附，连接成片，见多聚物的分泌，呈膜状包裹的典型生物膜性状。7 d后成熟生物膜表面多聚物的分泌量较培养3 d有明显增加，并连成大片生物膜。

生物膜形成前加入黄芩苷、黄芩素、阿奇霉素干预，培养7 d后，SEM观察黄芩苷、黄芩素、阿奇霉素组的结果相似：载体表面散在黏附着少量的铜绿假单胞菌，菌量比空白对照组明显减少，多聚物的分泌也不明显，细菌未表现出紧密黏附的状态，几乎未见生物膜形成。生物膜形成早期加入黄芩苷、黄芩素干预后SEM观察可见少量细菌散在地黏附在载体表面，多聚物的分泌不明显，几乎未见生物膜形成。而当生物膜完全形成后加入黄芩苷、黄芩素作用24 h后，SEM观察可见一定量铜绿假单胞菌黏附，多聚物的分泌量明显增多，与空白对照组比较减少明显，未形成大片的生物膜。SEM观察结果表明，黄芩苷、黄芩素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，且对早期生物膜形成的抑制作用比对成熟生物膜的抑制作用强。SEM观察结果见图1。

4 讨论

黄芩在临床上已广泛应用于上呼吸道感染、泌尿系统感染等治疗，其活性成分黄酮类化合物（黄芩苷、黄芩素等）对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和螺旋体等均具有抑制作用。目前有研究表明，大环内酯类药物在体外亚-MIC下显示了对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用[4]，而亚-MIC下黄芩水煎液对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用与大环内酯类相类似。本研究以阿奇霉素作为阳性对照，对生物膜内活菌计数结果分析无统计学差异，说明黄芩苷、黄芩素能抑制生物膜的形成。

图1 SEM观察结果A.载体在悬液中培养3 d（早期生物膜）；B.载体在悬液中培养7 d（成熟生物膜）；C.载体在含32 μg·mL-1黄芩苷的悬液中培养7 d；D.载体在含2 μg·mL-1黄芩素的悬液中培养7 d；E.载体在含1 μg·mL-1阿奇霉素的悬液中培养7 d；F.32 μg·mL-1黄芩苷对早期生物膜作用24 h；G.2 μg·mL-1黄芩素对早期生物膜作用24 h；H.32 μg·mL-1黄芩苷对成熟生物膜作用24 h；I.2 μg·mL-1黄芩素对成熟生物膜作用24 hFig 1 Results of SEMA.the vector in culture solution for 3 days（prophase biofilms）；B.the vector in culture solution for 7 days（maturate biofilms）；C.The vector was treated by baicalin with the concentration of 32 μg·mL-1for 7 days；D.the vector was treated by baicalein with the concentration of 2 μ g·mL-1for 7 days；E.the vector was treated by azithromycin with the concentration of 32 μg·mL-1for 7 days；F.the prophase biofilms was treated by baicalin with the concentration of 32 μg·mL-1for 24 h；G.the prophase biofilms was treated by baicalein with the concentration of 2 μg·mL-1for 24 h；H.the maturate biofilms was treated by baicalin with the concentration of 32 μg·mL-1for 24 h；I.the maturate biofilms was treated by baicalein with the concentration of 2 μg·mL-1for 24 h

SEM观察结果显示，黄芩苷、黄芩素体外能抑制铜绿假单胞菌对固体表面的黏附能力，显著抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，还能破坏铜绿假单胞菌已形成的早期和成熟期生物膜；且黄芩苷、黄芩素对生物膜的破坏效果与大环内酯类药物阿奇霉素相似。从而证明黄芩苷、黄芩素与阿奇霉素对铜绿假单胞菌早期生物膜的形成具有强大的抑制作用，对成熟生物膜的抑制作用则较弱。结合前期研究[1]可知，黄芩苷、黄芩素具有逆转MRSA耐药的作用，其机制可能与抑制PBP2a的表达有关。而黄芩一旦与某些抗菌药物联合应用就可以明显提高这些抗菌药物的杀菌效力，体外研究也证实中药可以促进抗生素对细菌的杀伤作用[5]，这些研究结果进一步促进了清热燥湿（解毒）中药的临床研究和应用，形成了中药“抗菌增敏”的概念。这也给笔者对于临床上使用黄芩对铜绿假单胞菌生物膜感染的防治提供了理论依据。但生物膜毕竟只是细菌耐药的机制之一，要完全弄清黄芩苷、黄芩素的“抗菌增敏”效应，还有待进一步的研究。

[1]陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究[J].中国药房，2008，19（9）：644.

[2]Coster T JW，Stewart PS，Greenberg EP.Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections[J].Science，1999，284（5 418）：1 318.

[3]徐志豪，刘富光，王选锭，等.红霉素、磷霉素对铜绿假单胞菌生物被膜体外作用的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2001，24（6）：342.

[4]张文元，杨亚冬，唐 靓.十四元环大环内酯类对细菌生物被膜形成的影响及对环丙沙星的增效作用[J].中国卫生检验杂志，2005，15（11）：1 288.

[5]林 杉，李仲昆，赵 云，等.双黄连粉针与头孢唑林伍用效果机理研究[J].中国药房，2000，11（1）：18.

Study on Inhibition Effect of Baicalin and Baicalein on the Formation of PseudomonasAeruginosa Biofilm

XIE Lin-li，ZHOU Mi，CHEN Yong-chuan，XIONG Li-rong，XIA Pei-yuan（Dept.of Pharmacy，Southwest Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To investigate the destructive effect of baicalin and baicalein on the formation of pseudomonas aeruginosa biofilm.METHODS：X140，a pseudomonas aeruginosa，was selected for investigation.After the biofilm was treated by baicalin or baicalein with the concentration of 32 μg·mL-1and 2 μg·mL-1，the numbers of viable bacteria were measured by serial dilution using azithromycin as control.The variations were observed under scanning electronic microscope（SEM）.RESULTS：Both of the baicalin and baicalein with the concentration of 32 μg·mL-1and 2 μg·mL-1could inhibit the adherence of pseudomonas aeruginosa significantly and the formation of biofilm（P＜0.01）.CONCLUSION：Baicalin and baicalein can inhibit the adherence of pseudomonas aeruginosa and the formation of biofilm.

Biofilm；Baicalin；Baicalein；Pseudomonas aeruginosa

R283；R97

A

1001-0408（2010）39-3651-03

2009-11-03

2010-03-12）