HL-60细胞培养上清液对人脐带血单个核细胞增殖的影响

郑 毅 ，陈代雄

（1.遵义医学院附属医院贵州省重点细胞工程实验室,贵州遵义563000；2.遵义医药高等专科学校 生理教研室，贵州 遵义563000）

1 材料与方法

1.1 HL-60细胞株 HL-60细胞源自人骨髓细胞的白血病细胞,购于中国科学院细胞库通过常规传代，冻存保护。

1.2 脐带血的来源 经知情同意后，无菌采集足月分娩脐血3例（肝素抗凝），每份50ml,采集后2h内进入实验程序。

1.3 主要试剂 本试验所用主要试剂见表1。

表1 主要试剂Tab 1 Main reagents

1.4 人脐带血MNCs分离 用PBS按1:1(V/V)比例稀释脐带血,按1:4(V/V)比例加入6%HES混匀,静止45min待沉降红细胞,出现清晰界面后吸取上清按1:3(V/V)比例用PBS稀释,1500rpm离心10min,细胞沉淀用PBS悬浮后，吸细胞悬液沿管壁缓慢注入到Ficoll淋巴细胞分离液(比重1.077)面上,1800rpm离心20min,吸取白膜层用PBS洗1次,沉淀用PBS悬浮,此即脐带血MNCs悬液。常规细胞计数。

1.5 HL-60细胞培养上清液的制备 复苏HL-60细胞后用PBS洗2次,沉淀用RPMI-1640(20%FBS)悬浮,以5.00×105/ml的细胞密度接种于培养瓶,置37℃，5%CO2饱和湿度环境下培养。培养第3天收集细胞,1500rpm离心15min,收集上清经0.22μm滤膜过滤。过滤液经镜检不含HL-60细胞。

1.6 脐带血MNCs的体外扩增 扩增培养设有6个实验组:①HL-60细胞培养上清液+StemSpan誖SFEM;②StemSpan誖SFEM;③HL-60 细胞培养上清液+HG-DMEM;④HG-DMEM;⑤HL-60 细胞培养上清液+LG-DMEM;⑥LG-DMEM,各组培养液中均含有10%的FBS。将分离的脐带血MNCs以5.0×105/ml的密度(即每瓶细胞总数为2.50×106)分别接种入上述6组不同的培养体系中,置37℃，5%CO2，饱和湿度环境下培养。培养第4天各组用相应的培养液半量换液,以后每隔1天半量换液。

1.7 脐带血MNCs体外扩增效果的检测 各组分别于第3,6,9,12天在倒置显微镜下观察细胞的增殖情况,并进行细胞计数(细胞总数),绘制增殖曲线。

1.8 统计学分析 所有实验数据采用统计软件SPSS For Windows 12.0进行处理。如果方差齐，采用t检验;如果方差不齐,则采用t’检验.样本数据以均数±标准差(x±SD)表示。P<0.05表示差异有显著性意义，P<0.01表示差异有非常显著性意义。

2 结果

不同培养体系对人脐带血MNCs增殖动力学的影响：从表2和图1可知，至第3d,HL-60细胞培养上清液+StemSpan誖SFEM和StemSpan誖SFEM组的MNCs数均明显升高,第9d仍处于较高水平;而其余4组的MNCs随培养时间推移呈逐渐下降,其中以未加HL-60细胞培养上清液的HG-DMEM和LGDMEM组下降尤为明显;HL-60上清液+StemSpan誖SFEM和StemSpan誖SFEM组在各个时间上的MNCs数均无明显差异（P>0.05）,但添加HL-60上清的高糖组和低糖组各时点MNCs数均高于相应的对照组(均 P<0.05)。

HL-60细胞培养上清液高糖组各时间点MNCs数明显高于高糖组 (P<0.05)(见图2）；HL-60细胞培养上清液低糖组各时间点MNCs数也明显高于低糖组(P<0.05)(见图 3)。

表2 不同培养体系对人脐带血MNCs增殖动力学的影响Tab 2 Effect of various cultural system on proliferation of MNCs from UCB(x±SD，n=3)

图2 H+HG和HG培养中人MNCs数变化的比较H+HG:HL-60细胞培养上清液+HG-DMEM;HG:HGDMEM;*与HG比较P<0.05Fig.2 comparison of number of MNCs cultured with H+HG and HG respectively

图3 H+LG和LG培养中MNCs数变化的比较H+LG:HL-60细胞培养上清液+LG-DMEM;LG:LGDMEM;*与LG比较P<0.05Fig.3 comparison of number of MNCs cultured with H+LG and LG respectively

3 讨论

目前，通常采用SCF,EPO,FL,IL-1,IL-3,IL-6细胞因子组合方案进行脐带血MNCs的体外扩增，在缺乏细胞因子的培养体系中，脐带血MNCs随时间延长则逐渐减少。结果表明,SFEM组和添加HL-60上清SFEM组随培养时间推移,MNCs均明显升高,至第9天仍可维持在较高水平。尽管添加HL-60上清SFEM组与SFEM组相比,培养后MNCs无明显增加,但添加HL-60上清的其余实验组均较相应对照组的MNCs数明显升高,说明HL-60细胞培养上清液对MNCs具有一定的增殖作用。实验结果还表明,StemSpan誖SFEM作为MNCs扩增的基础培养基优于HG-DMEM和LG-DMEM，比较适合于MNCs的体外扩增。

许多研究证明，急性白血病细胞能分泌细胞生长因子，如 GM-CSF[1,2]，IL-6[3]，IGF-Ⅰ[4]等，本实验所显示的HL-60上清对MNCs的增殖作用可能与HL-60细胞分泌此类细胞因子有关。

实验首次证明HL-60细胞培养上清液对人脐带血MNCs具有一定的促进增殖作用,这可能与HL-60细胞培养上清液存在促进细胞增殖的细胞因子有关。

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[2]樊娟，徐功立，王春霞，等.急性髓性白血病细胞自分泌造血生长因子水平及其临床意义 [J].中国免疫学杂志，2000，5：283-285

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