阿胶低肽酶解液超滤工艺的实验研究

付英杰，田景振

(山东中医药大学药学院，山东济南 250355)

阿胶低肽酶解液超滤工艺的实验研究

付英杰，田景振*

(山东中医药大学药学院，山东济南 250355)

阿胶;低肽;酶解;超滤

目的:优选阿胶低肽酶解液的最佳超滤工艺。方法:通过考察超滤膜材质、酶解液的预处理方法、药液浓度、分子量截留值、操作压力及温度等因素对透过速率的影响，优选最佳工艺条件。结果:最佳超滤工艺为:取50 g阿胶粉制成阿胶低肽酶解液，稀释至1 000 mL，水浴预热至40℃，在柱压(0.15±0.01)MPa下分别经过截留分子量30 kD、3 kD的超滤膜超滤，并水洗一次。结论:该超滤工艺损失少、快速、高效。

阿胶为马科动物驴Equus asinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。性味甘、平，归肺肝肾经，功能补血、止血、滋阴润燥，主治血虚证。阿胶主含胶原蛋白，但胶原蛋白的消化吸收需要蛋白酶参与降解，而适应症患者则常见脾胃虚弱或胃肠道反应，服用阿胶不仅会造成患者消化系统的负担，而且药效也得不到充分的发挥，因此需将阿胶进行酶解，制成分子量低于3 kD的小分子肽，但阿胶经酶解后，酶解液中仍残存大分子蛋白。为此，笔者采用超滤法将此部分蛋白与小分子肽进行分离，并考察其影响因素及损失率，现报道如下:

1 仪器与试剂

1.1 仪器

中空纤维超滤膜(北京市旭邦膜设备有限责任公司)，紫外分光光度计(日立UV－3010)。

1.2 试剂

牛血清白蛋白(Albumin，Bovine Biotech，购于上海生工生物工程有限公司，批号:B67328);考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue G－250 Ultra Pure，购于上海生工生物工程有限公司，批号:0241B75);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 超滤膜使用条件的优选

2.1.1 超滤膜材质

阿胶酶解液性质较为稠厚，采用普通超滤膜易形成凝胶层，容易堵塞。故选用不易堵塞、易清洗、可反复利用，且对药液稳定性好的中空纤维膜。

2.1.2 酶解液的预处理

膜材内孔径甚小，药液流经膜面时，小分子通过膜而大分子物质则被截流，而沉积于膜面，组成一层致密的凝胶层，成为次级膜，阻碍分子量小于膜孔的物质通过。考虑到中药提取液为混悬体系，极易形成凝胶层，最好进行预处理［1］。

方法:按表1中的预处理方法对阿胶酶解液(MWt.＜3 kD低肽浓度为77.67 μg/mL)进行预处理，处理后的药液采用考马斯亮蓝法［2］测定MWt.＜3 kD低肽含量，结果见表1。

表1 阿胶提取液预处理方法实验结果

综合考虑，采用过单层滤纸的方法较为可行，但是滤速较慢，故采用先离心后抽滤的方法进行初精制。结果:滤速增加，效果较好。

2.1.3 膜截留值与膜孔径

超滤膜的孔径是以截留(95%)特定物质的相对分子量来表示的。阿胶酶解液的有效成分为分子量＜3 kD的低肽，但若直接采用分子量截留值为3 kD的中空纤维膜超滤，膜易堵，难以清洗且损失大，因此依次采用30 kD、3 kD的超滤膜超滤。

2.1.4 药液浓度

超滤的药液浓度不可过高，因为过高易形成凝胶层，使超滤膜的透过速率降低;也不可过低，过低则影响考马斯亮蓝测定，并延缓超滤时间［1］。

方法:将200 g阿胶粉制得的酶解液分别稀释制成相当于原药材0、25、50、75、100、125、150、175、200 g/L的药液，分别通过中空纤维超滤膜(分子量截留值为30 kD)，压力为0.15 MPa，测定5 min内的透过速率(mL/min)，结果见表2。

表2 药液浓度对透过速率的影响

由表2可知，药液浓度升高，超滤速度大幅降低，所以应将药液的浓度控制为原药材的25～50 g/L再进行超滤，后续实验采用将50 g阿胶粉制得的酶解液稀释至1 000 mL再进行超滤。

2.1.5 操作压力

超滤过程是以压力为驱动力的分离过程，所以操作压力是影响分离过程的主要因素之一。压力过大，可能会造成超滤器中空纤维膜纤维丝的断裂或瘪塌;压力过低则影响流通量［3］。故需要考察操作压力的大小。又因为中空纤维柱的透过速率会随操作时间的延长有变化，所以也需要考察不同操作压力下透过速率随时间的变化。

方法:将50 g阿胶粉制得的酶解液稀释至1 000 mL，按表3中的操作压力，通过中空纤维超滤膜(分子量截留值为30 kD)，测定5 min内的透过速率(mL/min)。超滤过程中操作压力与透过速率的关系见表3。

表3 超滤过程中操作压力与透过速率的关系

由表3可知，5 min内透过速率以在操作压力以0.12～0.18 MPa为最佳，操作压力超过0.18 MPa后透过速率开始下降，需要进一步考察操作压力对膜透过速率随时间的影响。

方法:将50 g阿胶粉制得的酶解液稀释至1 000 mL，按照表4中的3个操作压力，通过中空纤维超滤膜(分子量截留值为30 kD)，时间安排如表4，测定每隔5 min的透过速率(mL/min)，结果见表4。

表4 操作压力对膜透过速率随时间的影响(mL/min)

由表4可知，压力为0.15 MPa时该阿胶药液的透过速率较高，且随着超滤的进行，透过速率下降较慢，故超滤最适宜的压力范围为(0.15±0.01)MPa。

2.1.6 药液温度的影响

由于本实验超滤膜为中空纤维膜，使用温度要求低于45℃，据文献报道［4］，温度在11～43℃时，随料液温度的升高，膜透过速率呈明显上升趋势，且在超滤过程中，温度高的料液其透过速率始终大于低温料液。但是，温度过高会导致药液中的有效成分变性。为了加快超滤速度，我们在膜材料及被处理料液允许的温度范围内，尽可能采用较高的温度即40℃。

2.2 超滤工艺的研究

方法:取50 g阿胶粉配成预实验药液，稀释至1 000 mL，水浴预热至40℃，在柱压(0.15±0.01)MPa下经过截留分子量为30 kD的超滤柱，将超滤液浓缩至约400 mL;将浓集液分3次水洗及1次碱洗:水洗3次的体积分别为约300，100，100 mL，之后分别收集3次水洗超滤液;碱液采用0.3% NaOH水溶液150 mL(注:碱洗为超滤柱洗涤的主要方法，在超滤液收集与实际生产中并无实际意义，本文仅作为一项实验数据);利用考马斯亮蓝法测定各部分总肽含量，并计算各部分占原药液低肽含量的百分比。然后将30 kD超滤液及3次水洗液合并，定容至1 000 mL，通过截留分子量3 kD的超滤柱，实验与检测方法均同30 kD超滤。结果见表5。

表5 超滤损失考察实验结果

由表5可知，30 kD和3 kD的超滤柱都至少需要水洗一次，可保证原药液低肽含量为75%以上。因为水洗1次之后再进行水洗的效果不明显，所以生产实际中可采用超滤后水洗1次的方法。

3 小结与讨论

3.1 本实验对阿胶酶解得到的低肽溶液进行了分次超滤，通过考察超滤膜材质、酶解液的预处理方法、药液浓度、分子量截留值、操作压力及温度等因素，得出最佳超滤工艺为:取50 g阿胶粉制成阿胶低肽酶解液，稀释至1 000 mL，水浴预热至40℃，在柱压(0.15±0.01)MPa下分别经过截留分子量30 kD、3 kD的超滤膜超滤，并水洗一次。

3.2 由于酶解方法较为繁琐，操作时间长，故本实验采用的是单因素考察法，而未进行平行实验;关于多因素的交互作用，有待进一步研究。

［1］黄楚华，殷学伦.超滤法制备胎盘肽的初步研究［J］.中国生化药物杂志，1994，15(2):133.

［2］徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件探讨［J］.江西医学检验，2003，21(5):353.

［3］贺立中.超滤技术在制剂生产中的应用［J］.中国药学杂志，1995，30(12):711.

［4］汪涛，曾庆祝，叶于明.采用超滤技术分离扇贝边酶解液［J］.中国水产科学，2002，9(3):255.

R284.2

B

1001－1528(2010)07－1241－03

2009－08－14

付英杰(1983－)，男，博士研究生。Tel:(0531)89628597 E－mail:pilipili@163.com