烫狗脊的质量标准研究

步显坤， 许 枬， 袁 野， 单国顺， 贾天柱

(辽宁中医药大学，辽宁大连116600)

中药狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz(L.)T.sm.的干燥根茎。始载于《神农本草经》，为草部中品。具有补肝肾、强筋骨、舒经络、除湿痛及利尿的功效，用于腰腿酸软、下肢无力、风湿痹痛［1］。狗脊炮制方法历史悠久，初见于《雷公炮炙论》:“细剉了，酒拌蒸”，现行2005年版中国药典只收载砂烫法［2］。传统炮制理论认为狗脊砂烫后其补肝肾作用增强［3］，与其他中药配伍，在临床中用于治疗骨质疏松症［4］、颈椎病［5］、神经脊髓炎［6］等老年性疾病。随着社会人口的老龄化，老年性疾病日渐增多，狗脊的临床用量也越来越多。2005版中国药典狗脊炮制项下虽收载“烫狗脊”品种，但缺少质量控制标准，因此建立有效的方法用于烫狗脊质量的控制，保证临床疗效十分必要。目前有关烫狗脊质量控制研究鲜有报道。鉴于上述原因，本实验采用TLC法对烫狗脊进行了定性鉴别研究，并采用HPLC测定了烫狗脊中原儿茶酸的含量，用于烫狗脊的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪;KQ-250BB型数控超声波清洗器超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);FA1004B万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司);sartorius-CP225D十万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。原儿茶醛对照品(供鉴别用，中国药品生物制品检定所，批号:0810-9402);原儿茶酸对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号:110809-200503);薄层硅胶预制板(青岛海洋化工品厂分厂、烟台化学工业研究所、青岛谱科分离器材有限公司);甲醇、乙腈均为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

试验所用烫狗脊分别产于湖南、广东、广西、云南、福建、江西、四川等地，共12批;药材经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz(L.)T.sm.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 色谱条件

硅胶G预制板(青岛海洋化工品厂分厂、烟台化学工业研究所、青岛谱科分离器材有限公司);展开剂:三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8);显色剂:1%三氯化铁-2%铁氰化钾溶液(1∶1);点样量:对照品溶液2μL，供试品溶液3～6μL。

2.1.2 供试品和对照品溶液的制备

对照品溶液的制备精密称取原儿茶醛和原儿茶酸对照品各2 mg，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取烫狗脊2 g，加入1%冰醋酸水配置的70%甲醇溶液50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 色谱层析方法

精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液各3～6μL，点于同一硅胶G薄层板上，照薄层色谱法(中国药典一部附录VIB)操作，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铁-铁氰化钾溶液，放置至斑点显色清晰。薄层色谱结果见图1。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Cromasil柱(250 mm×4.6 mm;5 μm);流动相:乙腈-1%醋酸水(5∶95);流速:1 mL/min;柱温:25℃;检测波长:260 nm;进样量:10μL。理论塔板数按原儿茶酸计算，不低于5 000。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称定原儿茶酸对照品加70%甲醇(1%醋酸配制)制成0.053 7 mg/m L的溶液，作为原儿茶酸对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

图1 烫狗脊薄层鉴别色谱图

取药材粉末(过20目筛)1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入1%冰醋酸水配置的70%甲醇溶液25 mL，密塞，称重，超声处理30 min，取出，放冷，称重，必要时补重，0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 测定方法

精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪中，测定色谱峰面积，计算原儿茶酸的含量。供试品溶液与对照品溶液的色谱图分别见图2、图3。

图2 烫狗脊中原儿茶酸含量测定高效液相色谱图

图3 原儿茶酸对照品高效液相色谱图(3.22的色谱峰为溶剂峰)

2.3 含量测定方法学考察

2.3.1 提取溶剂的选择

经对回流提取的方法与超声处理的提取方法比较，结果表明提取效率相当，因此提取方法选定较为简单的超声处理提取法;另外，不同溶剂的提取效率考察的结果显示70%甲醇的冰醋酸水溶液提取率最高;70%甲醇的冰醋酸水溶液不同提取时间考察发现，超声处理30 min提取效率最高。因此确定提取方法为:70%甲醇的冰醋酸水溶液超声处理30 min。

2.3.2 流动相的选择 通过对不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸为流动相考察色谱分离条件，结果显示乙腈-1%冰醋酸系统色谱分离度最好，冰醋酸的用量对保留时间、分离度影响也较大。加入2%、1.5%、1.2%、1%冰醋酸后分离度的结果表明，乙腈-1%冰醋酸水(5∶95)色谱分离度最佳，理论板数最高，因此确定乙腈-1%冰醋酸水(5∶95)为流动相。

2.3.3 检测波长的确定

测定原儿茶酸甲醇溶液的紫外吸收光谱，结果表明，最大吸收在260 nm，因此确定检测波长为260 nm。

2.3.4 系统适用性实验

采用Kromasil，Diamond，Agilent ZOBAX 3 种ODS 填料色谱柱(4.6 mm×250 mm)，对所建立的烫狗脊含量测定色谱系统进行考察，结果表明，原儿茶酸色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数大于3 000。

2.3.5 对照品的选择

狗脊中含有大量的糖类和氨基酸类成分，但是目前没有这类成分的单体化合物成分报道。而其酚酸类成分(狗脊中另一类主要成分［7］)中的原儿茶酸和原儿茶醛含量较高，其抗炎活性［8］与狗脊的药理作用［9］相近。而且狗脊砂烫后原儿茶酸含量增高［9］，超过万分之二，因此本实验中采用原儿茶酸作为含量测定的对照品。

2.3.6 方法学考察

2.3.6.1 线性关系考察 分别吸取原儿茶酸对照品溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 μL 注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱峰面积，以原儿茶酸的进样量为横坐标，色谱峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程:Y=3 570.2X－48.345(r=0.999 4)。原儿茶酸进样量在0.064 5～0.516μg范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.3.6.2 精密度试验 分别精密吸取上述原儿茶酸对照品溶液10μL，连续进样5次，按上述色谱条件测定色谱峰面积，RSD为1.64%，说明仪器精密度良好。

2.3.6.3 稳定性试验 取湖南烫狗脊1 g(批号:080703)，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8 h 注入高效液相色谱仪，测定原儿茶酸峰面积，计算其RSD为1.11%，表明供试品溶液在8 h内具有良好的稳定性。

2.3.6.4 重复性试验 精密称定湖南产烫狗脊5份(批号:080703)，按2.2.3项下方法分别制备成供试品溶液，按2.2.1项下含量测定方法测定原儿茶酸的峰面积，计算RSD为1.32%，说明该方法的重复性良好。

2.3.6.5 加样回收率试验 精密称定湖南烫狗脊(批号080703)粉末0.5 g，共6份，分别加入原儿茶酸对照品溶液6、7.5、9.0 mL，按 2.2.3项下方法制备成供试品溶液，按2.2.1项下含量测定方法测定原儿茶酸含量，计算回收率。原儿茶酸的平均回收率为99.10%，RSD为2.47%，结果见表1。

2.3.6.6 样品测定 分别取不同产地，不同批次的烫狗脊药材粉末(过20目筛)1 g，精密称定，按2.2.3项下方法制备成供试品溶液，并按2.2.1项下色谱条件进行测定，计算含量。结果见表2。

表1 原儿茶酸回收率试验测定结果

表2 12批烫狗脊原儿茶酸含量测定结果

3 讨论

3.1 薄层鉴别对照品的选择

狗脊化学成分研究表明，其主要含有为酚类、糖、蛋白质、挥发油等成分。但是糖类成分和蛋白质成分目前没有可供定性鉴别使用的合适的对照品。而其酚类成分中以原儿茶醛和原儿茶酸的含量较高，而且二者的活性与狗脊的功效相近，这也是2005年版中国药典狗脊定性鉴别项下采用原儿茶酸和原儿茶醛作为对照品的主要原因。鉴于狗脊砂烫后，原儿茶醛和原儿茶酸含量明显增高，因此本实验在建立烫狗脊的薄层定性鉴别时，采用原儿茶醛和原儿茶酸为对照品。

3.2 薄层色谱展开剂的选择

经对多批药材反复试验，选定分离度较好的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8)为展开剂。该展开剂对原儿茶酸和原儿茶醛分离好，而且毒性小。通过三个厂家硅胶G预制板的平行实验，供试品色谱均有很好的分离度。

3.3 薄层鉴别显色剂的确定

原儿茶酸和原儿茶醛均为酚性成分，与三氯化铁-铁氰化钾显色灵敏。因此显色剂确定为2%三氯化铁-1%铁氰化钾(1∶1)溶液。由于该显色剂长时间放置后，容易产生沉淀，因此最好预先分别配置2%三氯化铁水溶液和1%铁氰化钾水溶液，临用时现配制成1∶1的溶液。

本研究建立的烫狗脊的定性、定量检测方法具有简便快速、灵敏度高、重复性好、准确的特点，为烫狗脊的质量控制提供可靠的方法。

［1］中国药典［S］.一部.2005:155.

［2］贾天柱，李 军，黄 非，等.狗脊炮制历史沿革的研究［J］.辽宁中医学院学报，2001，3(2):136.

［3］叶定江.中药炮制学［M］.上海:上海科学技术出版社，2002:131.

［4］辛效毅.中医药治疗骨质疏松症60例［J］.四川中医，1997，15(7):46.

［5］贾存恩.颈安散治疗颈椎病100例［J］.吉林中医药，1997，17(3):25.

［6］阴 健.中药现代研究与临床应用(3)［M］.北京:中医古籍出版社，1997:182.

［7］胡彦武，于俊林.中药狗脊的化学成分及药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17(2):275-276.

［8］原 忠，余江天，苏世文.用薄层扫描法测定中药狗脊和黑狗脊中原儿茶酸及咖啡酸的含量［J］.沈阳药科大学学报，2000，17(5):338.

［9］鞠成国.中药狗脊炮制原理研究［D］.大连:辽宁中医学院，2002.