补肾健脾颗粒质量标准研究

王 珍， 李 矗

(1.安徽省药品审评认证中心，安徽合肥230022;2.安徽医科大学附属安徽省立医院，安徽合肥230001)

补肾健脾颗粒是根据临床经验方开发的中药复方制剂，由骨碎补、川牛膝、独活等中药组成，具有补肾健脾，活血散寒之功，用于治疗骨性关节炎证见脾肾两虚、寒湿瘀阻证。本文采用薄层色谱法对其中的骨碎补、川牛膝、独活、党参、当归进行定性鉴别，采用HPLC法对骨碎补中的有效成分柚皮苷进行含量测定，可有效控制补肾健脾颗粒的质量。

1 仪器、试药与样品

岛津LC-10AT型高效液相色谱仪(单元泵，紫外检测器，浙大N2000色谱工作站);天津奥特塞斯AT-130型柱温箱;UV-1700型紫外分光光度计(岛津);超声波清洗器HS3120型。柚皮苷对照品(批号110722-200307，供含量测定用)，川牛膝对照药材(批号121066-200203);独活对照药材(批号 130940-200205)，党参对照药材(批号 121057-200303)，党参炔苷对照品(111732-200804)，阿魏酸对照品(批号110773-9910)，均购于中国药品生物制品检定所。乙腈、磷酸为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为化学纯。补肾健脾颗粒由安徽九鼎医药科技有限公司提供(规格:每袋装10 g)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 骨碎补的鉴别［1］取本品3 g，加水50 mL搅拌，微热使溶解，用乙醚萃取2次，每次30 mL，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。见图1。

图1 骨碎补鉴别薄层色谱图

2.1.2 川牛膝的鉴别［2］取本品研细，取细粉5 g，加75%乙醇50 mL，加热回流提取1 h，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水5 mL使溶解，水溶液用乙醚10 mL振摇提取，提取液挥干乙醚，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取川牛膝对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(8∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。阴性对照无干扰。见图2。

2.1.3 独活的鉴别［3］取本品3 g，加水50 mL搅拌，微热使溶解，用乙醚萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，低温(30℃)挥干乙醚，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取独活对照药材0.6 g，加乙醚10 mL，超声处理5 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各7μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。见图3。

图2 川牛膝鉴别薄层色谱图

图3 独活鉴别薄层色谱图

2.1.4 党参的鉴别［4］取本品10 g，研细，加甲醇100 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm，柱高10 cm)，用水50 mL洗脱，弃去水液，再用50%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取党参对照药材1 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，自“残渣加水10 mL使溶解”起，同法制成对照药材溶液。再取党参炔苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液与对照药材溶液各5μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图4。

2.1.5 当归的鉴别 取本品10 g，加1%碳酸氢钠溶液100 mL，搅拌10 min，静置，取上清液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。见图5。

图4 党参鉴别薄层色谱图

图5 当归鉴别薄层色谱图

2.2 柚皮苷的含量测定

据文献报道，骨碎补能改变软骨细胞功能，推迟细胞退行性变，降低骨关节病的发病率及发病程度，推迟发病时间［5］，为本方中的君药。参考中国药典2005年版一部中骨碎补和枳壳［6］项下柚皮苷的含量测定方法，并结合本剂型特点，研究建立HPLC法测定本方中柚皮苷含量，进行方法学考察，该方法分离度良好，简单、灵敏、可靠。

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:Waters C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(19.5∶80.5);检测波长:283 nm;柱温:25℃;流速:1.0 mL/min;进样量:20μL;理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3 000。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取减压干燥至恒重的柚皮苷对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含柚皮苷40μg)。

2.2.3 供试品溶液制备 取本品研细，取细粉2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，密塞，超声处理30 min，放冷，再称定重量，甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性溶液制备 取按处方量制备的缺骨碎补的空白样品，照供试品溶液的制备方法制备。

2.2.5 阴性干扰试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各20μL，按上述色谱条件进行测定，结果阴性溶液在与对照品相应的保留时间处无峰出现，可见本品中其它成分对柚皮苷的测定无干扰。见图6。

图6 对照品、样品、阴性样品HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察 精密量取浓度为0.039 mg/mL和0.195 mg/mL的柚皮苷对照品溶液各5、10、15μL，按前述色谱条件注入液相色谱仪，计录峰面积。以柚皮苷浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，计算，得回归方程为:Y=708 793X－7 700.8，r=0.999 9。表明柚皮苷在0.195～2.925μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.7 供试品精密度试验 取按供试品溶液制备法制备的供试液(批号040402)，按上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，记录柚皮苷峰面积分别为479 284、485 766、478 891、483 806、471 237、481 021，RSD=1.05%，表明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 将按供试品溶液制备法制备的供试液(批号040402)于 0，1，2，4，6，8 h 按上述色谱条件重复测定1次，记录柚皮苷峰面积分别为482 004、491 344、489 396、483 830、497 579、476 929，RSD=1.52%。表明供试液在 8 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取同一批号样品(批号040402)共6份，按供试品溶液制备法制备供试液，精密量取该溶液和对照品溶液各20μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，计算柚皮苷含量分别为 0.84，0.86，0.86，0.84，0.85，0.85 mg/g，RSD=1.05%。表明方法重复性良好。

2.2.10 回收率试验 精密量取已知含量(0.85 mg/g)的同一批号的样品(批号040402)1 g共6份，再分别精密加入0.284 mg/mL柚皮苷对照品甲醇液3 mL，混合均匀，水浴蒸干，以下按供试品溶液的制备方法配制成供试液。分别取该溶液和对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算柚皮苷含量，结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=6)

2.2.11 样品测定 对3批小试样品(批号分别为040401，040402，040501)和 3批中试样品(批号分别为 060601，060602，060603)按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别精密吸取样品溶液和对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 本品为中药复方制剂，采用薄层色谱鉴别方法对方中的主要药味均进行了鉴别，并进行了阴性对照试验，结果其方法简便且专属性强，可有效控制本品的质量。其中川牛膝的薄层色谱鉴别在2005年中国药典一部中未收载，文献中报道亦较少，大多采用显微鉴别和理化鉴别，其专属性较差，本文采用的方法具有很强的专属性，可为川牛膝药材和含川牛膝制剂的色谱鉴别提供参考。

3.2 骨碎补中柚皮苷的含量测定方法文献报道较多，但在本制剂中尚未见报道。我们参考药典骨碎补药材项下含量测定项，流动相为甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)进行操作，结果柚皮苷出峰时间过长，达28 min，且塔板数较低，约为5 000;参考药典枳壳药材项下流动相:乙腈-水(21.5∶80.5)，用磷酸调节至pH3，柚皮苷塔板数达9 000，调节乙腈与水的比例，结果得到了较好的出峰时间(16 min)。

3.3 曾对含量测定中供试品溶液提取方法进行了考察，药典是采用甲醇回流提取3h，考虑到本品骨碎补药材投料时采用醇提工艺，所以进行了不同时间的回流和超声处理比较试验。结果表明采用文中的方法即甲醇超声30 min，功率120 W，频率40 kHz为佳。

［1］何夏秋，贺建华，马燕琼，等.用薄层法鉴别与测定千金救心胶囊中柚皮苷的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2003，9(4):10-12.

［2］杜志谦，江海肖，夏华玲，等.筋骨痛消丸的质量标准研究［J］.中国实验方剂学杂志，2002，8(4):13-15.

［3］苗明三，李振国主编.现代实用中药质量控制技术［M］.第一版，北京:人民卫生出版社，2002:778，825.

［4］中国药典［S］.一部.2010:264.

［5］赵湘洪，陈宝兴，丁继华，等.骨碎补对实验性骨性关节炎的治疗作用［J］.中国中药杂志，1987，12(10):41.

［6］中国药典［S］.一部.2005:180，171.