维药瘤果黑种草子质量标准研究

王园姬， 陈 文， 骆从艳， 慕春海， 李超鹏

(新疆石河子大学药学院教育部重点实验室，新疆石河子832000)

黑种草为毛茛科植物瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn)的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实，除去泥沙及果皮，晒干［1］。目前作为药用的有3个种，分别为瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn)，又名腺毛黑种草;果黑种草(Nigella sativa Linn)，又名家黑种草;以及黑种草(Nigella damascene L.)［2］。

瘤果黑种草子为新疆维吾尔族和西双版纳傣族习用药材，别名斯亚旦。其功效为利尿、活血、解毒、通乳;还可乌发、延缓衰老［3］。化学成分主要有黄酮、皂苷、脂肪酸、挥发油和生物碱等［4］。国外有文献报道其生物活性主要为抗氧化、降血糖［5］、抗肿瘤等［6］。已有研究证实瘤果黑种草子中含有多种常春藤皂苷类化合物［7，8］，并有对其中总黄酮测定的研究［9］，但尚未见有关于常春藤皂苷元含量测定的报道。原药材的质量标准也仅有性状鉴别。本实验建立了其薄层鉴别的方法，并进一步建立了HPLC测定瘤果黑种草子中常春藤皂苷元含量。实验结果表明该方法准确、快速、专属性强，为瘤果黑种草子药材质量标准的修订提供了实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 600型高效液相色谱仪，Waters2996检测器;UV-2401型紫外可见光分光光度计(日本岛津);Sartorius(BP211D)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);超声波提取器。

1.2 试药 瘤果黑种草子对照药材(中国药品生物制品检定所，批号121428-200501);常春藤皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所，批号820-20002);硅胶G(青岛海洋化工有限公司)。水为自制超纯水;乙腈为色谱纯试剂，其他溶剂为分析纯试剂。瘤果黑种草子(购自新疆乌鲁木齐市二道桥药材市场)，由新疆石河子大学药学院成玉怀副教授鉴定为瘤果黑种草子(Nigella glandulifera Freyn)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别 称取常春藤皂苷元对照品适量，用甲醇溶解配制成0.16 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。称取瘤果黑种草子药材粉末(过30目筛)与对照药材各约0.5 g，分别加70%乙醇加热回流提取1 h，常压过滤。滤液分别作为供试品溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法试验，用毛细管分别吸取供试品溶液、对照药材溶液及常春藤皂苷元对照品溶液适量，点于同一硅胶G薄层板上，以苯-甲醇-甲酸(17∶6∶1)为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%的硫酸-乙醇试液，105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材及常春藤皂苷元对照品色谱相应的位置上，显示清晰可见的紫色斑点。见图1。

2.2 HPLC测定

2.2.1 色谱条件与系统适用 色谱柱:Kromasil100-5C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相:乙腈-0.05%磷酸水(68∶32);检测波长:208 nm;柱温:20℃;流速:1.0 mL/min;进样体积:20μL。理论板数按常春藤皂苷元峰计不低于4 000。对照品及样品色谱图见图2。

图1 瘤果黑种草子TLC薄层图

图2 常春藤皂苷元(A)对照品和瘤果黑种草子药材(B)HPLC图谱

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的常春藤皂苷元对照品适量，加甲醇制成0.21 mg/mL的溶液，即得。吸取此对照品溶液1 m L到10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，得浓度为0.021 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 称取本品粗粉(过30目筛)约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声提取30 min，滤过，残渣再加甲醇50 mL，超声提取30 min，甲醇适量清洗残渣，合并滤液与洗液，减压挥干溶剂。残渣加10 mL水溶解，水饱和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，减压挥干溶剂。残渣加甲醇20 mL，盐酸4 mL，70℃加热水解4 h。水解产物加水10 m L，氯仿萃取2次，每次20 mL，合并萃取液，减压挥干溶剂。残渣用甲醇溶解并转移至50 m L量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察 按上述色谱条件，精密吸取0.021 mg/mL对照品溶液3 mL于5 mL量瓶中，得浓度为12.6 μg/mL对照品溶液。分别精密吸取12.6μg/m L的对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 到5 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度(浓度分别为 0.252、0.504、1.26、2.52、5.04、10.08 μg/mL)，分别精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积Y积分值为纵坐标，常春藤皂苷元的浓度C(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，常春藤皂苷元的回归方程为:Y=208 596×C－10 088(r=0.999 9)，表明常春藤皂苷元进样量在0.252～10.08μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液(浓度为5.04 μg/mL)20μL，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积，常春藤皂苷元峰面积的RSD为0.24%(n=6)。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液在0、2、4、6、8、12 h后，依法测定，常春藤皂苷元峰面积的RSD为2.0%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 称取瘤果黑种草子药材5份，每份约1.0 g，分别精密称定，制备成供试品溶液，测定峰面积，常春藤皂苷元峰面积的RSD为1.3%(n=5)。

2.2.8 加样回收率试验 称取已知含量的瘤果黑种草子药材9份，每份各约0.03 g，分别精密称定，加入常春藤皂苷元对照品溶液(10.08 μg/mL)0.8 mL、1.0 mL、1.2 m L，制备成供试品溶液，进样测定峰面积，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

2.2.9 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定5份药材样品。测定结果见表2。

表2 样品测定结果(n=5)

3 讨论

3.1 本实验建立的薄层色谱鉴别方法，分离度好，显色后斑点颜色清晰。

3.2 瘤果黑种草子中的三萜皂苷以常春藤皂苷元为苷元。由于三萜皂苷极性较大，先用甲醇进行超声提取;根据皂苷在水饱和正丁醇中溶解性较好的性质，再用水饱和正丁醇提取皂苷，然后加酸水解。由于三萜皂苷水解成常春藤皂苷元，极性变小，所以用极性小的有机溶剂氯仿提取常春藤皂苷元。在各步萃取过程中，注意两相之间的静置分层，尤其是第一步水饱和正丁醇萃取时，切勿剧烈振摇，避免乳化现象，使分层不明显，影响含量测定结果的准确性。

3.3 常春藤皂苷元分子结构中无共轭体系，属于末端吸收，紫外吸收较弱。根据文献采用高效液相-二极管阵列检测器，确定检测波长为208 nm。此波长下常春藤皂苷元的峰与其他峰分离良好，峰面积最大，故选择208 nm作为检测波长。

3.4 在含量测定过程中，考虑到常春藤皂苷元处于末端吸收，且甲醇本身就对其测定有干扰，故选择乙腈-0.05%磷酸作为流动相，进行等度洗脱，常春藤皂苷元的峰能与其它相邻峰达到很好的分离，且基线较平稳，峰型好。

［1］中国药典［S］.一部.2005:241.

［2］新疆植物志编辑委员会.新疆植物志［M］.第2卷第2分册，第1版.新疆:科技卫生出版社，1995:35-36.

［3］倪君君，王喆星，吴立军.瘤果黑种草子化学成分的研究［D］.沈阳，沈阳药科大学，2007.

［4］刘玉明，杨峻山，刘庆华.瘤果黑种草子化学成分的研究［J］.中国中药杂志.2005，30(13):980-982.

［5］Kanter M.Effects of Nigella sativa and its major constituent，Thymoquinone on sciatic nerves in experimental diabetic neuropathy［J］.Neurochem Res，2008，33:87-96.

［6］Khan M A.Chemical composition and medicinal properties of Nigella sativa Linn［J］.Inflammopharmacology，1999，7(1):15-35.

［7］倪君君，吴兆华，高慧媛，等.瘤果黑种草子的化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2007，24(4):215-218.

［8］郝海峰，任丽娟，陈玉武.黑种草子化学成分研究［J］.药学学报，1996，31(9):689-694.

［9］艾尼娃儿·艾克木，美丽万· 阿不都热依木，王岩，等.维吾尔药黑种草子中总黄酮含量的测定［J］.时珍国医国药，2008，19(5):1167-1168.