酸吸入致大鼠肺纤维化初步探索

陈石，张德平

(1.南京市胸科医院呼吸科，江苏南京 210029;2.南京市鼓楼医院呼吸科，江苏南京 210008)

研究报告

酸吸入致大鼠肺纤维化初步探索

陈石1，张德平2

(1.南京市胸科医院呼吸科，江苏南京 210029;2.南京市鼓楼医院呼吸科，江苏南京 210008)

目的研究实验性酸吸入与大鼠肺间质纤维化的相关性及其可能的作用机制，并与传统的博来霉素致纤维化作一比较。方法健康雄性SD大鼠120只，随机分为正常对照组、博来霉素组、高浓度盐酸组、中浓度盐酸组和低浓度盐酸组，每组24只。博来霉素组气管内一次性注入博来霉素诱导纤维化，盐酸组每周气管内滴注不同浓度盐酸1次，正常对照组每周气管内滴注生理盐水1次。各组分别于造模后第7、14、28及42天随机处死6只，取肺组织行HE、Masson染色评价肺组织病理变化，用RT－PCR方法测定肺组织转化生长因子β1(TGF－β1)的mRNA表达，用免疫组化的方法半定量测定I型胶原蛋白、结缔组织生长因子(CTGF)的表达。结果盐酸组肺泡炎程度始终显著高于对照组，在开始2周内达到一个高峰，随后仍旧维持一个相对较高状态，28 d达到或者超过博来霉素组水平。盐酸组纤维化程度随时间逐渐增强，显著高于对照组，但始终未超过博来霉素组。盐酸组肺组织TGF－β1mRNA在28 d时达到博来霉素组水平，至42 d时全面超过博来霉素组水平。博来霉素组大鼠各时间点肺组织I型胶原表达均显著高于正常阴性对照组及3个盐酸组。高、中浓度盐酸组CTGF表达从14 d起高于正常阴性对照组，且随滴注次数及时间增加而增强。结论本实验从一个角度反映了经常性胃食管酸反流引起的酸吸入与肺纤维化的相关性，为揭示胃食管反流病(GERD)与特发性肺纤维化(IPF)的关系提供了初步的实验室证据。

肺纤维化;胃食管反流病;盐酸;博来霉素

胃食管反流病(GERD)与多种呼吸系统疾病有关，如慢性咳嗽、哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、慢性阻塞性肺疾病［1－5］。但它对肺部的纤维化及损伤有时却被忽略。而近年来随着24h食管pH监测仪等先进仪器的应用，让人们逐渐认识到胃食管反流可能对特发性肺纤维化的影响。从1976年Mays等［6］第一次报道了临床上GERD与肺纤维化的相关性至今，有多篇文献报道特发性肺纤维化(IPF)与GERD的相关性［7－9］。最近Raghu［10］进行了一项类似的统计研究，65名确诊为IPF的患者，GERD的发病率高达87%。因此人们推测GERD引起的酸吸入可能与肺纤维化存在某种联系［30］。

Popper等［11］报道了向动物气管内滴入酸可以引起动物肺损伤及纤维化。在酸性条件下肺泡细胞可能被酸破坏，使肺表面活性物质的产生减少，加之富含蛋白成分的血浆渗出，可进一步加重肺组织损伤及纤维化程度。

但至今尚没有一种动物实验从病理、蛋白表达、mRNA基因水平等多角度揭示实验酸吸入引起肺纤维化的动态演变过程。本实验分别用病理切片分析、免疫组化蛋白半定量鉴定、PCR等多种方法，观察盐酸(胃酸的主要成分)对肺部造成的损伤，以及它和肺纤维化之间可能存在的相关性进行研究，探讨二者之间联系可能的病理生理机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

博来霉素A5针剂(天津太河制药有限公司)、盐酸(南京化学试剂有限公司)、半定量逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)试剂、Trizol(美国Invitrogen公司)、SuperscriptTMⅢReverse Transcriptase (SuperscriptTMIII逆转录酶)试剂盒(美国Invitrogen公司)、Oligo(dT)(美国Invitrogen公司)、PCR试剂盒(TaKaRa TaqTM，大连宝生物工程有限公司)、鼠转化生长因子β1(TGF－β1)单克隆抗体(美国R＆D公司)、大鼠CTGF单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，I型胶原单克隆抗体(美国sigma公司产品)、PV－6000二步法免疫组化试剂盒(北京中衫金桥生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立和分组:健康雄性SD大鼠120只，体重180～200 g，南京大学模式动物研究所提供【SCXK(苏)2005－0002】。随机分为5组:正常对照组(N组)、博来霉素组(B组)、高浓度盐酸组(H组)、中浓度盐酸组(M组)及低浓度盐酸组(L组)，每组24只。盐酸临用前用蒸馏水稀释成0.2、0.1及0.05 mol/L 3个浓度组，每周给予3个盐酸组气管内滴注1次(2 m L/kg)。正常组每周气管内给予等体积生理盐水1次。博来霉素组一次性气管内给予博来霉素(5 mg/kg)。

1.2.2 取材:各组分别在造模后第7、14、28及42天随机处死6只大鼠。氯胺酮腹腔注射麻醉后腹主动脉放血处死大鼠，开胸取肺组织，用生理盐水将肺组织漂洗数次，右肺上叶经4%甲醛液固定，常规石蜡包埋，HE染色、Masson三色染色及免疫组织化学染色。

1.2.3 肺组织病理分析:肺组织经不同浓度酒精常规脱水、石蜡包埋、切片后，分别给予HE和Masson三色染色。根据Szapiel等［12］的方法评价肺泡炎和肺纤维化的程度。肺泡炎分4级:无肺泡炎(－)，评0分;轻度肺泡炎(+)，评1分，表现为单核细胞浸润使肺泡隔增宽，仅限于局部和近胸膜部，面积小于全肺的20%，肺泡结构正常;中度肺泡炎(++)，评2分，受累面积占全肺的20%～50%，近胸膜部较重，重度肺泡炎(+++)，评3分，面积大于50%，偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变。肺纤维化分4级:无纤维化(－)，评0分;轻度纤维化(+)，评1分，受累面积小于20%，纤维化累及胸膜及胸膜下的肺间质，肺泡的结构发生紊乱;中度纤维化(++)，评2分，病变范围约占全肺的20%～50%，纤维化区域从胸膜延伸，仍属局部性;重度纤维化(+++)，评3分，病变范围大于50%，并有融合，可见大小不等的囊气腔。

1.2.4 肺组织中TGF－β1－mRNA的表达:采用半定量RT－PCR测定，Trizol法提取肺组织总RNA后，逆转录合成cDNA进行PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下:(1) TGF－β1:上游5′－GCTAATGGTGGACCGCAAC－3′，下游:5′－GCAGTGAGCACTGAAGCGA－3′，目的片段长度340 bp;(2)β－actin:上游:5′－GAGACCTTCAA CACCCCAGC－3′，下游:5′－CACAGAGTACTTGCGCT CAG－3′，目的基因片段长度654 bp。PCR反应扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/m L溴化乙啶)后，凝胶成像及分析系统下扫描分析，用TGF－β1及β－actin扩增产物的吸光度比值表示每个标本的相对mRNA水平。

1.2.5 肺组织中CTGF与I型胶原的表达测定:采用免疫组化EnVision二步法，分别按CTGF与I型胶原检测试剂盒说明书进行，

1.2.6 结果分析:免疫组化结果以肺组织中出现棕黄色为阳性显色，并用Image－pro plus专业图像分析软件系统(美国Media Cybernetics公司)分别对CTGF与I型胶原的表达进行定量分析，在400倍视野下，每张切片随机选取5个视野，测定积分吸光度来代表CTGF的表达量，在100倍视野下，每张切片随机选取5个视野，测定积分吸光度来代表I型胶原的表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 肺组织病理学改变

2.1.1 肺泡炎程度比较:正常阴性对照组(N组)肺泡壁薄，结构正常，无特殊改变。博来霉素阳性对照组(B组)气管内滴注博来霉素7d后，大鼠肺泡间隔及肺泡内即出现明显的炎症反应，可见大量的炎症细胞浸润，显著强于正常阴性对照组(N组)(P＜0.01);此后随时间推移，炎症细胞减少，逐渐以纤维化改变为主，可见多灶性，大小不等的纤维化区域。而在3个盐酸组肺泡炎症在开始两周内达到一个高峰，随后仍旧维持一个相对较高状态，自28 d达到或者超过博来霉素阳性对照组(B组)水平。各组肺泡炎程度见表1。

表1 各组大鼠肺泡炎评分结果(±s)Tab.1 The alveolitis scores in each group of rats(±s)

表1 各组大鼠肺泡炎评分结果(±s)Tab.1 The alveolitis scores in each group of rats(±s)

注:与N组比较，★P＜0.01;与L组比较，▲P＜0.05;与H组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01Note:Compared with the normal group，★P＜0.01;Compared with the group L，▲P＜0.05;compared with the group H，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01

组别(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N组(Normal group)0.17±0.41 0.33±0.52 0.17±0.41 0.00±0.00 B组(Bleomycin group)2.17±0.75★▲2.00±0.89★1.17±0.75★◆◆1.00±0.63★◆◆H组(Group H)2.17±0.75★▲2.33±0.52★2.17±0.41★2.00±0.00★M组(Group M)1.50±0.55★1.67±0.52★1.67±0.52★1.50±0.55★L组(Group L)1.33±0.82★1.83±0.98★1.50±0.55★◆1.33±0.52★◆

2.1.2 纤维化程度比较:Masson三色染色判断肺组织纤维化程度，正常阴性对照组(N组)大鼠肺组织含有少量胶原纤维，未见特殊异常改变。博来霉素阳性对照组(B组)大鼠早期即出现肺间质纤维化，肺间质纤维化逐渐加重，至28d达到顶峰，后逐渐有所下降。盐酸组早期纤维化程度低，随时间推移和滴注盐酸次数的增加，纤维化程度逐渐增强，虽然没有达到博来霉素阳性对照组的纤维化程度，但显著强于正常阴性对照组(P＜0.01)，但3个盐酸组的纤维化程度都没有超过博来霉素阳性对照组。结果见表2和图1(彩插8)。

表2 各组大鼠肺纤维化评分结果(±s)Tab.2 The pulmonary fibrosis scores of rats in each group(±s)

表2 各组大鼠肺纤维化评分结果(±s)Tab.2 The pulmonary fibrosis scores of rats in each group(±s)

注:与N组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01;与B组比较，■P＜0.05;与H组比较，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，★P＜0.05，★★P＜0.01;Compared with the bleomycin group，■P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

组别(Group)7d 14d 28d 42d N组(Normal group)0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.41 0.33±0.52 B组(Bleomycin group)1.33±0.52★★2.00±0.63★★2.50±0.55★★1.83±0.41★★H组(Group H)0.67±0.52★★■1.00±0.63★★■1.33±0.52★★■1.67±0.52★★M组(Group M)0.67±0.52★★■0.83±0.75★★■1.17±0.41★★■1.50±0.55★★L组(Group L)0.50±0.55★■0.67±0.52★■0.83±0.75★★■1.00±0.63★★■◆

2.2 肺组织中TGF-β1m RNA的表达

博来霉素阳性对照组(B组)TGF－β1mRNA在7、14 d表达显著高于其他各组(P＜0.05)，但表达水平逐渐下降，至第28天时与正常阴性对照组(N组)差异无显著性(P＞0.05)。3个盐酸组在第7、14天两个时间点显著低于博来霉素阳性对照组(P＜0.05)，自第28天起3个浓度盐酸组肺组织TGF－β1 mRNA表达水平与博来霉素阳性对照组差异无显著性(P＞0.05)，42 d时3个浓度盐酸组TGF－β1 mRNA表达水平已经高于博来霉素阳性对照组(P＜0.05)。结果见表3、图2。

表3 大鼠肺组织中TGF－β1mRNA的表达结果(±s)Tab.3 The expression of TGF－β1 mRNA in the rat lung tissues(±s)

表3 大鼠肺组织中TGF－β1mRNA的表达结果(±s)Tab.3 The expression of TGF－β1 mRNA in the rat lung tissues(±s)

注:与N组比较，*P＜0.05;与B组比较，▲P＜0.05;与H组比较，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，*P＜0.05;Compared with the bleomycin group，▲P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

组别(Group)7d 14d 28d 42d N组(Normal group)0.46±0.12 0.44±0.08 0.43±0.16 0.45±0.10 B组(Bleomycin group)0.86±0.24*0.95±0.18★0.73±0.13*0.47±0.11 H组(Group H)0.62±0.06*▲0.70±0.08*▲0.82±0.11*0.87±0.11*▲M组(Group M)0.58±0.08▲0.62±0.09*▲0.72±0.21*0.79±0.22*▲L组(Group L)0.53±0.11▲0.59±0.16*▲0.63±0.12*◆0.72±0.06*▲

注:Maker:DL2000 marker;B:博来霉素阳性对照;N:正常对照组;H:高浓度盐酸组;M:中浓度盐酸组; L:低浓度盐酸组;β－act:内参图2各实验组大鼠肺组织28 d时TGF－β1 mRNA的表达Note:Maker:DL2000 marker;B:Bleomycin group;N:Normal group;H:H igh－dose HCl group;M:Middle－dose HCl group;L:Low－dose HCl group;β－act:Internal standardFig.2 The expression of TGF－β1 mRNA in the rat lung tissues at 28 d

2.3 肺组织CTGF的表达

CTGF是调节成纤维细胞生长和ECM合成的宿主因子，是TGF－β1促纤维化效应的下游介质，在肺纤维化过程中发挥重要作用。文献报道CTGF蛋白在肺纤维化中表达显著增加，与肺间质纤维化的程度密切相关。本实验研究表明CTGF在正常阴性对照组(N组)肺组织均为弱表达或不表达。博来霉素阳性对照组(B组)CTGF的表达在从7 d开始出现升高，14 d达到高峰，以后出现下降。高、中浓度盐酸组(H、M组)CTGF表达随时间增加而增强，自42d起与博来霉素组差异无显著性(P＞0.05)。结果见表4及图3(彩插8)。

表4 不同时间点各组大鼠肺组织CTGF表达(A值，±s)Tab.4 The expression of CTGF in rat lung tissue at different time points in each group(A，±s)

表4 不同时间点各组大鼠肺组织CTGF表达(A值，±s)Tab.4 The expression of CTGF in rat lung tissue at different time points in each group(A，±s)

注:与N组比较，*P＜0.05;与B组比较，▲P＜0.05;与H组比较，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，*P＜0.05;Compared with the bleomycin group，▲P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

组别(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N组(Normal group)1269.67±427.30 1388.83±200.71 1415.17±376.54 1313.17±434.63 B组(Bleomycin group)3906.83±798.86*4873.67±730.18*3887.17±728.11*3143.17±598.97*H组(Group H)1839.50±473.74▲2233.33±616.78*▲2646.33±861.03*▲3044.00±649.84*M组(Group M)1759.83±270.66▲1784.00±313.46▲2325.83±684.07*▲2739.67±634.44*L组(Group L)1469.50±301.67▲1657.67±314.71▲◆1961.00±320.52▲2408.50±606.19*▲

2.4 肺组织I型胶原的表达

由于纤维化的肺中过度的TGF－β1和CTGF的表达，导致I型和III型胶原的增生，胶原在肺间质中沉积，使肺组织基质结构紊乱形成纤维化。本实验结果显示，博来霉素阳性对照组(B组)大鼠各时间点肺组织I型胶原表达均显著高于正常阴性对照组(N组)(P＜0.05)，与肺组织病理形态学改变相一致;高中低3个浓度盐酸组(H、M、L组)各时间点I型胶原表达始终低于博来霉素组(P＜0.05)。中低浓度盐酸组自28d起I型胶原纤维表达强于正常阴性对照组(P＜0.05)，但始终没有达到高浓度盐酸组及博来霉素组的I型胶原表达程度。结果见表5、图4(彩插8)。

表5 不同时间点各组大鼠肺组织I型胶原表达(I A值，×103，±s)Tab.5 The expression of collagen type I in the rat lung tissues at different time points in each group(I A，×103，±s)

表5 不同时间点各组大鼠肺组织I型胶原表达(I A值，×103，±s)Tab.5 The expression of collagen type I in the rat lung tissues at different time points in each group(I A，×103，±s)

注:与N组比较，*P＜0.05;与B组比较，▲P＜0.05;与H组比较，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，*P＜0.05;Compared with the bleomycin group，▲P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

组别(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N组(Normal group)14.12±5.31 15.51±4.66 14.69±5.86 18.49±4.94 B组(Bleomycin group)39.91±13.73*58.31±21.37*82.99±11.53*79.95±10.97*H组(Group H)21.84±7.24▲37.28±13.67*▲46.72±15.96*▲60.12±10.19*▲M组(Group M)18.65±6.32▲22.63±11.25▲◆33.03±3.67*▲◆40.37±14.89*▲◆L组(Group L)14.20±5.23▲16.80±7.77▲◆28.36±11.22*▲◆36.82±8.79*▲◆

3 讨论

本实验通过反复多次微量低浓度酸注入，既模拟胃食管反流引起的微量误吸，又可以观察酸对肺纤维化发生发展所起的作用以及纤维化程度与酸的浓度的关联性，防止了肺水肿的发生。通过观察7、14、28及42 d四个时间点的肺组病理学改变、TGF－β1mRNA、TGF－β下游因子CTGF的表达、I型胶原纤维定量来了解实验性酸吸入对肺组织的真正影响。

博来霉素诱导的肺纤维化模型虽然无法完全模拟人类IPF的慢性纤维化进展过程［13］，但由于目前尚无更好的动物模型，仍是目前公认的和人类肺间质纤维化最相似的动物模型［14－15］。因此本实验选用博来霉素造模作为阳性对照组，生理盐水组作为阴性对照组，与3个不同浓度的盐酸组进行比较。

肺组织病理结果显示，正常对照组肺泡结构正常，而博来霉素组大鼠早期即出现肺间质纤维化，后期随时间推移有所下降，与文献报道基本相符［16］。而3个盐酸组的肺泡炎呈逐渐增强趋势，从28 d起全面超过博来霉素组。这表明3个盐酸组的肺泡炎从范围和程度上不断增加。并随时间推移和滴注盐酸次数的增加，纤维化程度逐渐增强。

在参与肺纤维化的细胞因子中，TGF－β是作用最为关键的细胞因子［17］。其中TGF－β1与肺纤维化关系最为密切，在肺纤维化发病机制中起着重要作用。CTGF是调节成纤维细胞生长和ECM合成的宿主因子，是TGF－β1促纤维化效应的下游介质。文献报道［18］CTGF蛋白在肺纤维化中表达显著增加，与TGF－β1、I型胶原蛋白表达量呈正相关。本研究发现，3个浓度盐酸组肺组织TGF－β1mRNA表达显著高于正常对照组，且有逐渐增加的趋势，至第28天和博来霉素组无显著性差异，CTGF表达规律也与此类似，这充分说明盐酸对纤维化形成有一定的促进作用，可以从基因水平上调肺组织内的TGF－β1及其下游介质CTGF蛋白的表达，从而促进肺纤维化发生发展。

由于TGF－β1和CTGF的表达增加，导致I型胶原的增生［19］，胶原在肺间质中沉积，使肺组织基质结构紊乱形成纤维化［20］。本实验结果显示，高中低3个浓度盐酸组各时间点I型胶原表达都未达到博来霉素组水平。但都有表达增加，体现了反复酸吸入致纤维化并逐渐增强的趋势。

本实验结果表明，微量酸造成的纤维化速度较为缓慢，但由于反复不断的盐酸滴注刺激引起异常及过度修复，使纤维化进程呈进行性加重，可能比博来霉素更好的模拟肺纤维化的病程，更加符合生理学演进和疾病发生发展过程。

由于实验条件和实验周期限制，虽然盐酸组的纤维化程度得到体现，但实验性酸吸入的浓度、频率与天然的胃酸浓度以及GERD胃食管反流的频率尚存在差距。同时，还应该认识到:肺纤维化的发病机制错综复杂，多种因素的参与并相互作用，还需要用各种手段监测更多的相关因子来观察酸对大鼠肺部的具体作用及其与纤维化之间的关系。

综上所述，实验性酸吸入可导致肺纤维化。本实验从一个角度反映了经常性胃食管酸反流引起的酸吸入与肺纤维化的相关性，虽然并不能完全模拟重建胃食管反流引起酸吸入对肺部的真正影响，但通过本实验可以更好地为揭示人类GERD与IPF的关系提供了初步的实验室证据。

(本文图1、3、4见彩插8。)

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Correlation of Experim ental Acid Aspiration and Pulm onary Fibrosis in Rats

CHEN Shi1，ZHANG De－ping2
(1.Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China;2.The Affiliated Drum Tower Hospital，Nanjing University Medical College.Nanjing 210008)

ObjectiveTo study the pathology and possible mechanism of experimental hydrochloric acid(HCl) inhalation induced pulmonary fibrosis in rats and make a comparison with traditional bleomycin－induced fibrosis.M ethods 120 male SD rats were random ly divided into nomal control group，bleomycin group，high－dose HCl group，middle－dose HCl group and low－dose HCl group.The bleomycin group was intratracheally injected bleomycin once to induce pulmonary fibrosis.The three HCl groups were intratracheally injected HCl once per week.The control group was given saline in the same way.Six rats of each group were random ly sacrificed on day 7，14，28 and 42，respectively.The histological changes of the lung tissue were evaluated by HE and Masson's trichrome staining.The mRNA expression of transforming growth factor－β1(TGF－β1)was assayed by RT－PCR，and the CTGF and collagen type I protein expressions were analyzed by immunohistochemistry.ResultsThe hydrochloride group had a significantly higher extent of alveolitis(P＜0.01)，reaching a peak at the first 2 weeks，and then still maintained at a relatively high status，and from 28 d to reach or exceed that in the bleomycin group.Hydrochloric acid group fibrosis gradually increases over time，significantly higher(P＜0.01 or 0.05)，but not consistently exceeded that in the bleomycin group(P＞0.05).Similar results appeared in the TGF－β1mRNA，I－collagen and CTGF expression in immunohistochemical assessment.ConlusionThe results of this studyindicate from the point of view a relationship between recurrent gastro－esophageal acid reflux caused by acid inhalation and pulmonary fibrosis，and provides preliminary experimental evidence for the relationship between gastroesophageal reflux disease(GERD)and idiopathic pulmonary fibrosis(IPF).

Pulmonary fibrosis;GERD;Hydrochloric acid;bleomycin;Rat

R－33

A

1005－4847(2010)04－0335－06

2009－09－27

江苏省医学135重点人才资助项目(编号:RC2001005)。

陈石(1981－)，男，研究方向:间质性肺病。E－mail:cshonest1981@sina.com

张徳平，E－mail:dpzhang207@yahoo.com.cn