烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型的建立与评价

曹君，陈平，杨悦，欧阳若芸，彭红

(中南大学湘雅二医院呼吸内科，长沙 410011)

研究报告

烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型的建立与评价

曹君，陈平，杨悦，欧阳若芸，彭红

(中南大学湘雅二医院呼吸内科，长沙 410011)

目的探讨单纯烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型建立及病理学、气道炎症及肺功能评价，并进行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)技术的改进。方法20只C57BL/6J小鼠随机分为正常对照及烟雾暴露组，烟雾暴露90 d并观察30 d后行小鼠肺功能检查、应用改进方法留取BALF行细胞计数及行肺组织病理切片观察，并与正常对照组进行比较。结果烟雾暴露组小鼠气道阻力(Raw)较正常对照组增高，动态肺顺应性(Cdyn)降低;BALF中细胞总数高于正常对照组，巨噬细胞数(AM)、中性粒细胞数(N)、中性粒细胞所占比例(N%)也高于对照组，差异均有统计学意义;病理学观察示烟雾暴露组肺泡腔扩大、部分肺泡间隔断裂、肺泡腔融合、肺气肿形成，气道上皮排列紊乱、部分气道上皮增生、周围炎症细胞浸润并伴有平滑肌增生;形态学计量分析示烟雾暴露组平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)较正常对照组增加。应用改进技术行BAL成功率100%，回收率高达90%。结论单纯烟雾暴露可以成功建立小鼠肺气肿模型且稳定可靠，与人类慢性阻塞性肺病相似性好，经BAL技术改进后该模型可行性高。

慢性阻塞性肺疾病;肺气肿;香烟烟雾;动物模型;支气管肺泡灌洗

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)由于其患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题［1］。阻塞性肺气肿(简称肺气肿)是COPD的主要病理表现。COPD是一种慢性进展性疾病，对人体进行直接研究无论是在技术上还是在道德伦理上均受限，故动物模型的建立及研究显得十分重要。目前国内已有多人采用单纯烟雾暴露成功复制肺气肿大鼠模型［2，3］，而关于小鼠肺气肿模型建立研究很少，但国外小鼠肺气肿模型应用广泛，考虑小鼠个体小、干预及取材等操作存在难度限制其在国内研究中推广。小鼠有易于饲养，繁殖能力强及实验费用低等优点;且与人类同源性高，是一种很好的研究人类疾病的动物模型。支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)是COPD动物模型研究中重要部分，获取的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)可通过计数炎症细胞、检测细胞因子水平等反映肺局部病理及生理变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

芙蓉牌香烟(焦油13毫克/支，湖南中烟工业有限责任公司)，Carl Zeiss Axioskop 40光学显微镜(德国Carl Zeiss公司)，静脉留置针(直型，22G，威海洁瑞医用制品有限公司)，PLY3211小动物肺功能检测系统(美国Buxco Electronics公司)。

1.2 动物分组

6周龄SPF级近交系C57BL/6J雄性小鼠20只，体重18～20 g，来源于中国科学院上海实验动物中心【SCXK(沪)2007－0005】，于中南大学湘雅二医院实验动物中心清洁房饲养，温度21～23℃，湿度50%～60%，昼夜12 h节律，自由进食、饮水。小鼠随机分为正常对照组及烟雾暴露组，每组10只。实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.3 肺气肿模型建立

小鼠适应性饲养两周后开始造模。采用自制的有机玻璃箱(69 cm×47 cm×38 cm)，玻璃箱1/2高度处置有机玻璃隔板(隔板上有直径1 cm圆形通风孔，排布密度:1个/6 cm2)将玻璃箱分为上下两部分，有机玻璃箱顶及四侧面下1/2均有圆形通气孔(箱顶:1个/100 cm2;侧面下1/2:1个/250 cm2)。将10只C57BL/6J小鼠置于隔板上，于玻璃箱下1/ 2空间内点燃6只香烟，至香烟燃烧完全、烟雾基本消失，约15 m in;掀开箱盖，休息5 m in，重复一次烟雾暴露。每日两次上述烟雾暴露，连续90 d，停止烟雾暴露后观察30 d。正常对照组小鼠亦同时放入另一自制有机玻璃箱中，呼吸空气。为初步观察烟雾暴露过程中肺病理变化，在烟雾暴露过程中第30天及90 d分别随机抽取正常对照及烟雾暴露组各一只小鼠行肺病理检查。

1.4 小鼠肺功能检测

烟雾暴露停止30 d，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉小鼠，固定，备皮、消毒后，剪开皮肤，轻柔钝性分离暴露气管，在气管软骨环之间水平剪开气管，插入导管并连接小动物肺功能仪进行肺功能测定，记录气道阻力(Raw)、动态肺顺应性(Cdyn)及呼气峰流速(PEF)等指标。描记一段平静呼吸后，于呼气末自接口处快速注入1.0 m L空气，使小鼠被动的深吸气，记录数据。小鼠肺功能检测在中南大学湘雅医学院机能实验中心进行，为保证肺功能数据质量，操作均由同一人进行。

1.5 支气管肺泡灌洗液的收集及计数

肺功能测定后颈椎脱臼处死小鼠，打开左侧胸腔，沿肺叶向上分离结扎左主支气管;自气管切开处置入22G静脉留置针套管并结扎气管，静脉留置针尾接1m L注射器针筒，较快速度注入无菌PBS 0.5 m L行单侧BAL，注入PBS后立即缓慢低负压回收液体，重复灌洗三次，回收率90%～92%。收集的BALF混匀后吸取20 μL于血细胞计数器上行细胞计数;余BALF于4℃1000 r/m in分离心10 min，取沉淀重悬于PBS液并制作3张细胞涂片，W right－Giemsa染色作细胞分类计数。

1.6 小鼠肺组织病理学观察及形态定量分析

结扎右侧主支气管及左上肺支气管并注入4%多聚甲醛至左下肺膨胀，随后将左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋、4 μm连续切片，常规苏木素－伊红(HE)染色，光学显微镜观察HE染色。平均内衬间隔(mean linear intercept，MLI)测定:每只小鼠取3个HE染色切片，低倍镜(×100)下随机取5个视野(避开大血管和支气管)，在每个视野正中心划十字交叉线，计数与交叉线相交的肺泡隔数(NS)，同时测出十字线总长(L)，按公式计算:MLI=L/NS，以表示肺泡平均内径。肺泡破坏指数(Destructive index，DI)的测定参照陈燕等［4］方法进行:每只小鼠取3个HE染色切片，每张切片低倍镜(×100)下至少观察20个非重复视野，分别以正常(N)或破坏(D)记录肺泡结构的破坏情况，要求每一例各切片的N、D值总和≥3000，以公式计算DI=D/(D+N)×100。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠一般情况观察

两组小鼠在实验前外观、对刺激的反应及体重均无明显差异。实验中烟雾暴露组小鼠在早期表现燥狂不安，随烟雾暴露时间延长而转为安静。在烟雾暴露后期，小鼠出现进食减少，行动迟缓，毛发干涩无光泽。烟雾暴露过程中无小鼠死亡。正常对照组小鼠饮食正常，活动灵敏，皮毛有光泽。

A:正常对照组B:烟雾暴露组C:肺功能流量－时间曲线图解图1小鼠肺功能流量－时间曲线(flow－time curve)变化A.Control group B.CS－exposed group C.Explanation of flow－time curve Fig.1 Flow－time curve of pulmonary function in mice

2.2 小鼠肺功能检测

肺功能流量－时间曲线(图1－C)下半部分为吸气相，上半部分为呼气相。与正常对照组相比(图1－A)，烟雾暴露组(图1－B)流量－时间曲线的上半部分上升支较陡直、而下降支斜度较小且伴有顿挫，呼气相延长。烟雾暴露组小鼠Raw较正常对照组增高明显，Cdyn较正常对照组低，差异均有统计学意义(P均＜0.05);烟雾暴露组呼气峰流速(PEF)较正常对照组稍低，但差异无统计学意义。见表1。

表1 两组小鼠肺功能结果比较(±s，n=8)Tab.1 Comparison of pulmonary function between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

表1 两组小鼠肺功能结果比较(±s，n=8)Tab.1 Comparison of pulmonary function between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

注:*与正常对照组比较，P＜0.05Note:*P＜0.05 vs.control group

分组Group气道阻力Airway resistance，kPa/(L·S)动态肺顺应性Dynamic lung compliance (L/kPa)呼气峰流速Peak expiratory flow rate，(mL/S)正常对照组(Control group)0.0365±0.020 0.3100±0.1367 8.38±1.08烟雾暴露组(CS－exposed group) 0.3179±0.097*0.1019±0.0004*7.20±0.97

2.3 BALF细胞计数及分类

应用改进方法BALA回收率高达90%以上，正常对照组及烟雾暴露组BALF回收率分别为(91.3 ±1.0)%、(90.5±1.3)%，两组BALF回收量及回收率无统计学差异(P＞0.05)。烟雾暴露组小鼠BALF细胞总数高于对照组，巨噬细胞数(AM)、中性粒细胞数(N)、中性粒细胞所占比例(N%)也高于正常对照组，差异均有统计学意义(P均＜0.05)。见表2。

表2 小鼠BALF中细胞计数及分类结果比较(±s，n=8)Tab.2 Comparison of cell counts and classification in BALF between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

表2 小鼠BALF中细胞计数及分类结果比较(±s，n=8)Tab.2 Comparison of cell counts and classification in BALF between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

注:*与正常对照组比较，P＜0.05Note:*P＜0.05 vs.control group

组别Group细胞总数Total cells(×108/L)巨噬细胞Macrophages (×108/L)巨噬细胞百分比Macrophage(%)中性粒细胞neutrophils (×107/L)中性粒细胞百分比neutrophil(%)正常对照组(Control group)1.47±0.24 1.34±0.14 87±9 0.77±0.09 8.7±1.0烟雾暴露组(CS－exposed group)5.85±0.67*4.45±0.63*76±8 7.76±0.92*13.7±2.4*

2.4 小鼠肺组织病理学改变及形态定量分析

正常对照组在各时间点肺组织病理无明显变化。与正常对照组小鼠比较(图2－A)，烟雾暴露30 d时小鼠肺组织可见炎症细胞浸润、部分肺泡腔轻度扩大(图2－B);至第90天时出现明显肺泡腔扩大、肺泡壁变薄、肺泡间隔破裂及肺泡腔融合，肺气肿形成(图2－C);停止烟雾暴露30 d，亦可见明显肺泡腔扩大及融合(图2－D)。停止烟雾暴露30 d，比较正常对照组及烟雾暴露组平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)，可见烟雾暴露组小鼠肺组织MLI及DI均较正常对照组高，差异有统计学意义(P均＜0.05)。见表3。图2见彩插2。

表3 小鼠肺组织MLI、DI结果(±s，n=8)Tab.3 The results of MLI and DI in mice(±s，n=8)

表3 小鼠肺组织MLI、DI结果(±s，n=8)Tab.3 The results of MLI and DI in mice(±s，n=8)

注:*与正常对照组比较，P＜0.05;MLI为平均内衬间隔;DI为肺泡破坏指数Note:*P＜0.05 vs.control group.

组别Group MLI Mean linear intercept(μm) DI Destructive index(%)正常对照组(Control group)33±3 13±3烟雾暴露组(CS－exposed group)52±7*39±4*

观察两组小气道病理表现，可见正常对照组小鼠气道壁结构清楚，气道上皮排列整齐，未见明显上皮脱落(图3－A)。而烟雾暴露组小鼠气道上皮排列紊乱、部分脱落、局部气道上皮增生(箭头E所示)、管壁增厚、管腔变小;气道周围大量炎症细胞浸润(箭头I所示)、部分气道周围肺泡等支撑结构缺失(箭头S所示)并伴有局部平滑肌增生(箭头SM所示)(图3－B，图3－C)。图3见彩插2。

3 讨论

COPD是一种严重危害人类健康的疾病，其发病率及病死率呈逐年上升的趋势。COPD发病机制不明，缺乏有效治疗方法，许多学者纷纷通过COPD动物模型的构建和研究，以进一步阐明COPD发病机制，寻找有效的治疗途径。对于肺气肿模型的建立成功与否，国内学者郑鸿翱［5］提出一个符合临床实际的理想COPD动物模型应满足以下条件:(1)致伤因素与临床COPD常见诱因基本一致;(2)必须有气流阻塞存在，小气道阻力增高，Cdyn下降; (3)气道重塑/建;(4)可伴有气道高反应性。该标准结合肺组织病理改变可以比较客观评价COPD动物模型。

长期吸烟是导致人类小叶中央型肺气肿的主要诱发因素，且烟雾暴露法较急性伤害性模型能模拟人长期吸烟引起的慢性发病过程，因此烟雾暴露诱发的动物模型的研究已成为肺气肿研究领域中的热点。我们既往研究［6，7］采用烟雾暴露成功建立COPD大鼠模型，并证实吸烟可致SD大鼠肺内出现炎症反应、氧化应激及蛋白酶/抗蛋白酶失调，但个体间存在一定的差异，造模过程中有4只大鼠死亡。

目前国内关于烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型研究十分少见。国内烟雾暴露所致肺气肿模型大多采用SD及W istar大鼠，均属封闭群，个体间遗传性差异较大，实验可重复性差，且SD大鼠对烟雾刺激及呼吸系统疾病有较强的抵抗;但采用近交系大鼠则实验成本较高。而小鼠作为一种常用的实验动物，具有价格便宜、繁殖和发育速度快、生理上个体差异较少等优点。此外，小鼠生物进化上与人类非常接近，其组织器官结构和细胞功能与人相似，人类99%的基因存在于小鼠，93%的小鼠区域基因排列顺序与人类相同，小鼠的许多疾病模型与人类同种疾病有着较高的可比性。且本研究采用的C57BL/ 6J小鼠为标准的近交系小鼠，个体差异很小，模型可重复性好，在国外广泛应用于肺部及其他疾病动物模型的研究中。

March等［8］研究发现就吸烟诱导的肺气肿而言，B6C3F1小鼠较F344大鼠更敏感。Nikula等［9］研究表明吸烟所致小鼠模型是一种可靠的肺气肿动物模型。Yao等［10］通过烟雾刺激C57BL/6J、A/J、AKR/J、CD－1及129SvJ五种不同品系小鼠，发现C57BL/6J小鼠对烟雾刺激高度敏感。Valenca等［11］将C57BL/6小鼠暴露于香烟烟雾中，3支香烟/次，3次/日，60 d后观察肺病理可见肺气肿样改变，伴肺泡巨噬细胞增多、细胞外基质改变及MMP－12表达增加。Van der Strate等［12］研究采用C57BL/ 6J小鼠，对鼻喷烟，2次/日，2支/次，10喷/支，每周5 d，发现小鼠烟熏至4个月后发生气腔扩大，并随熏烟时间增加而增加;同时烟熏小鼠肺组织有与人类肺气肿相似的随肺气肿进行性增加的B淋巴细胞滤泡。由此可见，烟雾暴露所致肺气肿C57BL/6J小鼠肺内存在与人类相似的病理生理改变，但上述研究均未对烟雾暴露停止后肺病理变化进行观察，且较少应用肺功能对模型可靠性进行评价。

本研究采用自制烟雾暴露箱对C57BL/6J小鼠进行全身香烟烟雾暴露，6支/次，4次/日，连续90 d，建立肺气肿小鼠模型，造模时间与国外研究［11，12］不一致，考虑与香烟种类、烟雾暴露方式、烟雾浓度、暴露时间及暴露频度有关。在造模过程无小鼠死亡，说明该方法安全性好。

肺功能是评价肺气肿模型建立的重要评价标准之一，本研究采用国际公认的BUXCO小动物肺功能检测系统，该设备技术先进、检测精确、数据可靠，国内仅有为数不多的几家大型科研单位拥有该设备。同时在检测过程中严格控制操作统一性，保证肺功能的结果可靠性。肺功能检查显示烟雾暴露组小鼠流量－时间曲线的呼气部分曲线上升支陡直，提示肺组织弹性较差;而后下降缓慢并伴有顿挫，呼气相延长提示小气道存在阻塞，呼出气流不畅。进一步肺功能数据分析显示:烟雾暴露组小鼠Raw明显增高，Cdyn明显下降，提示气道阻塞、肺动态顺应性下降，与COPD病理生理变化特点相符合。

BALF中炎症细胞计数及分类是反映气道炎症的一个重要指标，本研究中行单侧BAL结果示烟雾暴露组小鼠BALF中性粒细胞及巨噬细胞均增加，且以中性粒细胞增加为主，提示烟雾暴露可致肺局部炎症细胞的聚集，继而活化释放一系列炎症因子、趋化因子、氧自由基与蛋白酶等，导致炎症反应及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等一系列病理生理过程，参与肺气肿形成。

本研究亦初步观察了两组不同时间点肺组织病理改变，发现正常对照组小鼠各时间点肺部病理表现未见明显差异，无自发性肺气肿形成，与进一步论证该小鼠用于建立实验性肺气肿模型的可行性。而烟雾暴露组烟雾暴露第30天时小鼠肺组织即有局部炎症细胞浸润及部分肺泡腔扩大;继续暴露至第90天时可见典型的肺气肿病理改变。停止烟雾暴露并观察30 d，发现小鼠肺组织肺气肿程度未见减轻，似乎有进展趋势，提示所建肺气肿模型稳定性好且与人类COPD戒烟后肺损害持续进展的病程规律相符。而对于肺气肿动物模型小气道的观察，国内研究报道少，我们的研究发现烟雾暴露组气道上皮排列紊乱、局部上皮增生、气道周围炎症浸润、支撑结构缺失及平滑肌增生，提示烟雾暴露组存在气道重塑，与人类COPD表现一致。

上述肺功能、气道炎症及病理学评价指标证实该C57BL/6J小鼠肺气肿模型建立成功，符合人类COPD改变，且稳定性较好。

小鼠体积小，气管及支气管亦较细小且柔软，使用注射器法行BAL时极易损伤而致漏液及灌洗失败，影响进一步的研究。本研究组采用普通静脉留置针行灌洗术，成功率高。具体做法是:轻柔暴露气管后，丝线置于气管下备用，持静脉留置针自气管上段穿刺成功后退金属内芯并将塑料套管缓慢送入气管约0.4～0.8 cm，结扎气管，拔出金属内芯，留置针尾接1.0 m L注射器针筒行BAL，行BAL时回抽负压应尽量小，以有液体缓缓流出为宜，同时可适当改变动物体位以利于回收液体。而行单侧BAL时，可采用先从胸侧壁打开一侧胸腔沿肺叶向上寻找该侧主支气管并予结扎，自气管处置静脉留置针行对侧BAL，操作简单，无需完整分离双肺及主支气管。该方法损伤小，操作简单，灌洗成功率100%，回收率高达90%～92%;但该方法使用的直型静脉留置针成本较普通注射器高，不可高压消毒以重复利用，如实验不要求无菌则可清洗干净后重复使用。

本研究结果显示，烟雾暴露90 d可致C57BL/6J小鼠肺泡壁变薄、肺泡间隔破裂、肺泡腔扩大及融合、肺气肿形成，停止烟雾暴露后肺部病理改变不会减轻，且肺功能及气道炎症指标均证实模型的建立成功。本研究建立的烟雾暴露所致C57BL/6J小鼠肺气肿模型能较好地模拟人类COPD病理生理改变、慢性发病及进展的病程规律。该建模方法安全、经济、可靠且稳定性好，为进一步研究研究COPD的发病机制及寻找有效治疗方法提供了一个非常好途径。

(本文图2，3见彩插2。)

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Establishm ent and Assessm ent of a M ouse M odel of Cigarette Sm oke-Induced Em physem a

CAO Jun，CHEN Ping，YANG Yue，OUYANG Ruo－yun，PENG Hong
(Department of Respiratory Medicine，the Second XiangYa Hospital of Central South University，Changsha 410011，China)

Objective To set and evaluate a mouse model of cigarette smoke(CS)－induced emphysema and improve the method of bronchoalveolar lavage(BAL).M ethods Adult(n=10，18～20 g body wt)male C57BL/6J mice(CS－exposed group)were exposed 4 times per day，whole body，to CS from six cigarettes for consecutive 90 days and then to observe for another 30 days.The control group(n=10)was sham－smoked.An improved method of bronchoalveolar lavage was used and the data of pulmonary function，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and morphological manifestations were collected.Results Compared with the control group，the CS－exposed group owned higher airway resistance(Raw)，lower dynamic lung compliance(Cdyn)，more macrophages and neutrophils in BALF(all P＜0.05).Morphological detection showed significant enlarged airspace，disruption of alveolar septa and formation of emphysema.After using the improved method，success rate of BAL reached to 100%，and recovery rate was up to 90%.ConlusionCigarette smoke can induce emphysema stably in mice and this mouse model shows high similarity to human chronic obstructive pulmonary disease and is easy to manipulate after methodologic improvement.

Chronic obstructive pulmonary disease;Emphysema;Cigarette smoke;Animal model; Bronchoalveolar lavage

R－563.3，R－332

A

1005－4847(2010)04－0278－05

2009－12－18

国家科学自然基金资助项目(编号:30770931，30800503);湖南省自然科学基金资助项目(编号:09JJ3036，07JJ3037)。

曹君(1983－)，女，中南大学湘雅二医院呼吸内科在读博士生，主要研究方向:慢性阻塞性肺疾病发病机制，Email:path_cj71@ yahoo.com.cn

陈平，E－mail:chenping101@hotmail.com，Tel:13873115563