氰戊菊酯对牙鲆鳃细胞系体外的细胞毒性＊

兰 欣

(青岛职业技术学院生物化工学院,山东青岛266555)

氰戊菊酯对牙鲆鳃细胞系体外的细胞毒性＊

兰 欣

(青岛职业技术学院生物化工学院,山东青岛266555)

采用牙鲆鳃细胞系FG-9307,测定拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯的体外细胞毒性.细胞生长速度在测试质量浓度5,10和15μg/mL显著降低.此外,三种应用比较广泛的测试终点方法——中性红吸收实验法、四唑盐比色实验法、细胞蛋白分析法被用于检测氰戊菊酯的体外细胞毒性.实验证明三种测试方法的细胞毒性的相关性很高,并不因测试终点不同而不同.这说明FG细胞系有可能成为检测氰戊菊酯体外细胞毒性的合适的生物指标.

氰戊菊酯;牙鲆鳃细胞系;体外细胞

水环境中的污染物对海洋生物甚至整个生态系统都是潜在的威胁.鱼类急性试验是评估化学制品的水生生物毒性的常规方法.以前,大量的水体中化学制品的急性毒性数据来自成体鱼的LC50实验,即测定化学药品作用一段特定的时间(通常指96h)的半致死浓度.然而,这种体内实验成本高、费时,且需要特殊的实验设备.因此,需要建立快速有效的生物检测方法来检测化学制品的潜在毒性.Rachlin和Perlmutter(1968)首次提出将培养的鱼类细胞系用于水体污染物的急性体外细胞毒性分析.Kocan等(1979),Marion和Denizeau(1983),Bols等(1985),Babich等(1986),Babich和Borenfreund (1987)[1,2],以及Saito等(1991)[3]运用多种主要来源于淡水鱼类的细胞系将体外细胞毒性分析法进一步推广.最近,源于Poeciliopsis lucidas的鱼类肝细胞瘤的细胞系PLHC-1被Huuskonen等(1998)用于评价纤维素和木片提取物的急性细胞毒性.源于海水鱼Paralichthys olivaceus的牙鲆鳃细胞系FG-9307被用于测定有机磷农药的体外细胞毒性(李红岩等,2001;2002).

由于它的高杀虫性以及对哺乳动物、鸟类等的低毒性和低环境残留量(Giri等,2002;Vijveberg和Berckey,1990)[4],氰戊菊酯[(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基-(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯],是一种合成拟除虫菊酯类农药,广泛用于农业(Saito等,2000),因此成为一种可能导致生态系统改变的长效水生污染物(Woin, 1998)[5].氰戊菊酯的残留期为75～178天.氰戊菊酯在自然水体中对水生生物尤其鱼类是危险的(Rozanski,1992).氰戊菊酯的毒性被广泛研究于哺乳动物(De Souza Spinosa等,1999;Giri等, 2002;Hadnagy等,1999;Mandhane和Chopde, 1997[6];Singh和Jha,1996)以及淡水鱼类(Kamalaveni等,2001;Radhaiah和Rao,1990;Reddy等, 1991).然而,氰戊菊酯对海水鱼类以及他们的培养细胞的毒性效应知之甚少.在本研究中,FG-9307,一种来源于牙鲆Paralichthys O livaceus(童裳亮等, 1997)[7]的连续细胞系被用于氰戊菊酯的体外细胞毒性测定.

1 材料和方法

1.1 细胞和化学药品

本实验所用连续细胞系FG-9307来源于牙鲆鳃.细胞在20℃的基本培养基(MEM,Gibco BRL, New York)中培养,添加了质量分数为10%的小牛血清(BCS,Hyclone,Utah),100国际单位/mL的青霉素,100μg/mL的链霉素.

氰戊菊酯,Ⅱ型拟除虫菊酯类农药,使用含20%有效成分的乳化液.用此乳化液而不是化学纯物质是为了达到田间水平.乳化剂可以保护有效成分为离子态,从而可降低毒性(Coats等,1989).小牛血清白蛋白(BSA),中性红(NR),四唑盐(MTT)均来自Sigma公司(StLouis,MO,USA).

1.2 实验方法

1.2.1 氰戊菊酯对生长速度的影响

将汇合的细胞从25cm2培养瓶中收集,并用新鲜的质量分数10%小牛血清的MEM培养基稀释浓度至1×105个/mL.20000个细胞悬浮于200μL培养基加入96-孔板的每孔中,20℃孵育过夜.第二天弃去培养基,分别换上含0,5,10和15μg/mL氰戊菊酯的培养基.每个质量浓度做三个平行样.每天用童等(1997)[7]的原位计数法测定细胞密度,以细胞数/mm2表示.

1.2.2 氰戊菊酯对细胞毒性分析

将汇合的细胞从25cm2培养瓶中收集,并用新鲜的含有10%小牛血清的MEM培养基稀释浓度至1×105个/mL.20000个细胞悬浮于200μL培养基加入96-孔板的每孔中,20℃孵育过夜.第二天,弃去培养基分别换上新鲜培养基(作对照)和含有不同浓度氰戊菊酯的培养基.每个浓度做三个平行样.细胞培养48h后进行毒性检测.

1)中性红(NR)吸收实验

方法参照Borenfreund和Puerner(1985)[2]检测细胞生长所受的抑制,这是基于活细胞的溶酶体能够吸收活体染料中性红,而死细胞不能吸收这种染料的原理来进行的.

①经过48h的处理后,轻轻移去旧培养基,每孔加入200μL在20℃预热过夜的含50μg/mL中性红的培养基.

②20℃孵育3h.

③移去中性红溶液,加上预热至20℃的磷酸缓冲液轻轻冲洗.

④移去磷酸缓冲液,加入200μL解析液(冰醋酸◇质量浓度96%乙醇◇水=1◇50◇49,体积比).

⑤室温快速震荡10min,用酶联免疫仪在波长540nm处测定溶液的光吸收值.

⑥计算IC50值(即中性红吸收被抑制50%的受试农药的浓度).

2)四唑盐MTT检测

参照Borenfreund等[2]的方法,基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞则无此功能.

①经过48h的处理后,每孔加入20μLMTT的PBS溶液(MTT质量浓度为5 mg/mL),20℃继续培养4h;

②4h后,轻轻把溶液移去,加入预热至20℃的PBS溶液,轻轻地快速漂洗2次;

③每孔加入150μL DMSO以溶解细胞中的紫色结晶物;

④用酶标仪在波长为490 nm处测定其光吸收值,计算其I C50值.

3)细胞总蛋白含量测定(cell protein assay)

细胞蛋白分析采用Shopsis和Eng的方法,是检测经污染物处理后的细胞总蛋白含量的方法.

①氰戊菊酯处理48h后,轻轻移去旧培养基.

②细胞用温PBS轻轻漂洗后,加入50μL 0.1 mol/L的NaOH溶液裂解细胞.

③96-孔培养板20℃放置1h.

以上所有的实验做3次,每一剂量的平均吸收值换算为对照组吸收值的百分比.

2 结 果

2.1 对细胞生长的抑制作用

当FG-9307细胞暴露于氰戊菊酯中,它的生长速度在所有的3个测试质量浓度中均被抑制,这是一个质量浓度依赖过程.对照细胞培养48h后细胞密度为1.32×103个/mm2,经5,10,15μg/mL氯氰菊酯处理的细胞经48h培养后细胞密度分别为1.19×103,0.88×103,0.70×103个/mm2.生长曲线也说明细胞的生长被氰戊菊酯抑制(见图1).

图1 氰戊菊酯对FG细胞生长曲线的影响

2.2氰戊菊酯对细胞毒性分析

NR,MTT和细胞蛋白分析法测定的氰戊菊酯对细胞毒性结果都是相似的,不因所采用的细胞毒性测试终点方法不同而不同,见图2.实验所用的最低质量浓度的氰戊菊酯1μg/mL就对细胞表现出明显的毒性效应,并且毒性随质量浓度的增大而增大,呈现出质量浓度依赖性.从图2计算了NR,MTT和细胞蛋白分析法的I C50值,即48h内引起细胞毒性参数受抑制程度达到50%时的氰戊菊酯的质量浓度,分别为15.68,16.49,16.66μg/mL.

图2 氰戊菊酯对FG细胞体外细胞的毒性

3 讨 论

氰戊菊酯可以浓度依赖方式抑制细胞的生长速度,由于细胞生长速度的计算容易操作,FG细胞是个方便快捷的体外检测氰戊菊酯急性毒性的系统.三种广泛应用的测试终点方法——NR,MTT,细胞蛋白分析法表明三种测试系统的细胞毒性的相关性很高,并不因测试终点不同而不同.这与Ekwall的观点——当用依赖于细胞基本结构和功能的不同测试终点检测毒性时,大部分的细胞系对于毒物有类似的反应是吻合的.三种反应基于不同的毒性终点,中性红是基于溶酶体膜损伤,MTT分析反映了对线粒体酶的抑制,细胞蛋白含量的降低可反映对细胞生长的抑制.细胞生长是贴壁的,细胞死亡可由脱壁表示,因此细胞蛋白的减少可作为一个表示细胞死亡的数量指标(Charles Shopsis和Ben Eng,1985).由于在氰戊菊酯的最低受试浓度1μg/mL对细胞就有毒性,这说明FG细胞对氰戊菊酯很敏感,FG细胞有可能成为检测氰戊菊酯急性毒性的合适的生物指标.

据报道氰戊菊酯在浓度25μg/L时作用14天可使实验的鲤鱼全部死亡,一种拟除虫菊酯农药permethrin对鱼类的LC50在0.001～0.01mg/L范围内(H.Lutnika,1999)[8].而本实验测得IC50值用NR,MTT和细胞蛋白分析法分别为15.68,16.49和16.66μg/mL.看来鳃上皮细胞是动物和它的水环境的重要屏障,因此是污染物的首要作用对象.体外鱼类生态毒性评价方法的发展可促进探测及筛选水污染物的能力.

本文是首次报道海水鱼类细胞系用于氰戊菊酯的体外细胞毒性测定.

[1]Babich H,Borenfreund E.In vitro cytotoxicity of organic pollutants to bluegill sunfish(BF-2)cells[J].Environmental Research,1987,42:229-237.

[2]Borenfreund E,PuernerJ A.Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neural red absorption[J]. Toxicol.Lett.,1985,24:119-124.

[3]Saito H, Iwami S,Shigeoka T.In vitro cytotoxicity of 45 pesticides to goldfish GF-Scale(GFS)cells[J].Chemosphere,1991,23:525-37.

[4]Vijverberg H P M.Neurotoxicological effects and the mode of action of pyrethroid insecticides[J].Crit Rev Toxicol., 1990,21:105-126.

[5]Woin P.Short-and long-term effects of the pyrethroid insecticide fenvalerate on an invertebrate pond community [J].Ecotoxicol Environ Saf.,1998,41(2):137-56.

[6]Mandhane SN,Chopde C T.Neurobehavioral effects of low level fenvalerate exposure in mice[J].Indian J Exp Biol., 1997,35(6):623-7.

[7]Tong SL,Li H,Miao H Z.The establishment and partial characterization of a continuous fish cell line FG-9307 from the gill of flounder Paralichihys Olivaceus[J].Aquaculture,1997,156:327-333.

[8]Lutnika H,Bogacka T,Wolska L.Degradation of pyrethroids in an aquatic ecosystem mode[J].Was.Res., 1999,33(16):3441-3446.

I n Vitro Cytotoxicity of the Pyrethroid I nsecticide Fenvalerate to the Flounder(ParalichthysOlivaceus)Gill Cells

LAN Xin

(Department ofBiochemistry,Qingdao Vocational and Technology College,Qingdao Shandong 266555,China)

The FG-9307 cell line derived from the gill of flounder Paralichthys olivaceuswas used to determine the cytotoxic effects of the pyrethroid pesticide,fenvalerate in the present study.The cell growth rate was markedly reduced by fenvalerate at the concentrationsof 5,10 and 15μg/mL tested.In addition,threewidely used endpoint assays,NR,MTT and cell protein assays,showed that the in vitro cytotoxicity of fenvalerate was closely correlated in all the systems independent of the toxic endpoints employed.These make the gill cell line a good candidate for deter mining the acute in vitro cytotoxicity of fenvalerate.

fenvalerate,flounder gill cell line,in vitro Cell

book=9,ebook=379

Q 2

A

1673-2103(2010)05-0074-04

2010-05-16

国家科技部863项目(2001AA649040)

兰欣(1977-),女,四川成都人,讲师,硕士,研究方向﹕生物技术与分子营养学.