盐酸氨溴索联合布地奈德对致敏大鼠气道炎症及肺组织氧化应激水平的影响

周 娜，杜永成，张新日

(山西医科大学第一医院，太原 030001)

研究报告

盐酸氨溴索联合布地奈德对致敏大鼠气道炎症及肺组织氧化应激水平的影响

周 娜，杜永成，张新日

(山西医科大学第一医院，太原 030001)

目的 观察盐酸氨溴索联合吸入布地奈德对致敏大鼠气道炎症及肺组织氧化应激水平的影响。方法32只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、致敏组、布地奈德干预组(BUD)和氨溴索+布地奈德干预组(AMB+ BUD)。测定各组大鼠支气管肺泡灌洗液(ABLF)细胞计数及分类;取部分肺组织行HE染色病理学观察;测定肺组织中活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)含量。结果BUD+AMB组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞数、淋巴细胞数以及肺组织ROS含量均明显低于BUD组(P＜0.05，P＜0.01)，而肺组织GSH含量明显高于BUD组(P＜0.01);同时BUD+AMB组大鼠支气管壁炎症反应及病理损伤程度也较BUD组明显减轻。相关性分析显示:各组大鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数与肺组织ROS含量之间均呈正相关(P＜0.05)。结论氧化应激在哮喘发病过程中发挥着重要作用。盐酸氨溴索通过其抗炎、抗氧化作用，与吸入糖皮质激素合用对哮喘急性发作有协同治疗效果。

哮喘;布地奈德;盐酸氨溴索;活性氧(ROS);谷胱甘肽(GSH)

支气管哮喘(哮喘)是一种气道慢性非特异性炎症性疾病，病因和发病机制尚不完全清楚。糖皮质激素是目前治疗哮喘最有效的药物，然而，临床研究发现，部分哮喘患者应用糖皮质激素治疗后，症状虽然得到良好的控制，但其体内的活性氧水平依然很高，提示氧化应激(oxidative stress)在哮喘发病中具有一定作用［1］。因此，联合应用糖皮质激素和抗氧化治疗应比单用激素疗效更佳。本研究拟通过观察盐酸氨溴索联合吸入布地奈德对致敏大鼠气道炎症及肺组织氧化应激水平的影响，探讨盐酸氨溴索与吸入糖皮质激素对哮喘协同治疗作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组和哮喘模型的复制

健康雄性Wistar大鼠32只(由山西医科大学实验动物中心提供。合格证号:山医字第070101)，体重150～170 g，随即分为4组(n=8)，参照文献［2］报道方法并加以改进复制哮喘模型。①对照组:第1天和第8天腹腔注射生理盐水各1 mL，第15天雾化生理盐水，每天1次，每次30 min。②致敏组:第1天和第8天腹腔注射10%OVA各1 mL (包括卵白蛋白100 mg、氢氧化铝100 mg)，第15天开始雾化1%OVA，疗程同前，以初次雾化后出现点头运动、腹肌收缩为哮喘发作标志。③布地奈德干预(BUD)组:给药方法基本同致敏组，所不同的是每次雾化OVA前1h吸入0.02%布地奈德30 min。④氨溴索+布地奈德干预(AMB+BUD)组:给药方法基本同BUD组，所不同的是每次吸入布地奈德前25 min腹腔注射盐酸氨溴索(勃林格殷格翰公司产品)，剂量为60 mg/kg。各组总疗程均为10周。

1.2 标本采集与制作

疗程结束后颈动脉放血处死动物，结扎右主支气管，对左肺行支气管肺泡灌洗术(3 mL×4次)，回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，回收率60%～80%。取右肺部分组织用中性甲醛液固定，行普通病理学检查;剩余肺组织置于液氮中速冻，用以测定肺组织ROS和GSH含量。

1.3 BALF细胞计数及分类

将肺泡灌洗液注入离心管中，1 500 r/min离心15 min，移去上清液，留0.5 mL沉渣，沉渣即刻推片，吹干行HE染色，在高倍镜下至少计数300个细胞并分类。

1.4 肺组织病理学检查

切片行苏木精－伊红染色，光镜观察。

1.5 肺组织中ROS、总GSH含量的测定

取肺组织0.1 g，加入预冷的0.9 mL生理盐水，在冰上碾成匀浆，离心取上清液。测定方法按试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)说明书进行。

1.6 统计学方法

全部数据经SPSS12.0软件包进行统计分析，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，组间差异的显著性用方差分析，两两比较用 SNK－q检验法，相关关系用直线相关分析，以P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及分类

各组大鼠 BALF细胞计数及分类结果见表1。结果显示，BUD和BUD+AMB组BALF细胞总数、嗜酸粒细胞数及淋巴细胞数虽明显高于对照组(均P＜0.01)，但均较致敏组明显降低(均P＜0.05); BUD+AMB组BALF细胞总数、嗜酸粒细胞数及淋巴细胞数均明显低于BUD组(均P＜0.05)。

表1 BALF中细胞总数及分类计数的比较 (n=8，±s)(×107/L)Tab.1 The total cell number and numbers of different types of cells in the bronchoalveolar lavage fluid

表1 BALF中细胞总数及分类计数的比较 (n=8，±s)(×107/L)Tab.1 The total cell number and numbers of different types of cells in the bronchoalveolar lavage fluid

与正常对照组相比，*P＜0.05;与致敏组相比，#P＜0.05;与BUD组相比，△P＜0.05*P＜0.05，compared with the normal control;#P＜0.05，compared with the allergized group;△P＜0.05，compared with the BUD group.

组别Group细胞总数The total cell count淋巴细胞数Lymphocyte count嗜酸粒细胞数Eosinophil count正常对照组 Normal control 17.01±1.83 3.95±0.84 0.12±0.01致敏组 Allergized group 99.16±4.38*35.97±3.85*16.04±1.37*BUD组 BUD group 45.72±3.59*#15.67±1.27*#3.89±0.53*#BUD+AMB组 BUD+AMB group 30.95±2.68*#△8.91±1.20*#△1.51±0.21*#△

2.2 肺组织HE染色

HE染色光镜下观察，对照组大鼠支气管黏膜上皮及黏膜肌层完好，支气管管腔规则，周围无炎症细胞浸润;致敏组大鼠支气管上皮细胞肿胀、脱落，气道平滑肌层和网状基底膜层增厚，支气管呈收缩状态，管壁增厚，管腔变窄，管壁内及管周有大量以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。药物干预后，BUD+AMB组和BUD组大鼠支气管壁炎症反应及损伤程度均较致敏组明显减轻，其中以BUD+AMB组更为显著(图1～4，见彩插4)。

2.3 肺组织中ROS、GSH的含量

各组大鼠肺组织ROS及GSH含量测定结果见表2。结果显示，肺组织ROS含量从高到低依次为致敏组、BUD组、BUD+AMB组和对照组，GSH含量从低到高依次为致敏组、BUD组、BUD+AMB组和对照组，组间比较均有统计学意义 (均 P＜0.01)。

表2 大鼠肺组织ROS及GSH含量(n=8，±s)Tab.2 The ROS and GSH levels in the lung tissue of rats(n=8，±s)

表2 大鼠肺组织ROS及GSH含量(n=8，±s)Tab.2 The ROS and GSH levels in the lung tissue of rats(n=8，±s)

备注:与正常对照组比较，*P＜0.01;与致敏组比较#P＜0.01;与BUD组比较，△P＜0.01*P＜0.05，compared with the normal control;#P＜0.05，compared with the allergized group; △P＜0.05，compared with the BUD group.

组别Group活性氧ROS (U/mg pro)谷胱甘肽GSH (μmol/L)正 常 对 照 组Normal control 1517±152 1.69±0.10致敏组 Allergized group 5272±248*0.42±0.06*BUD组 BUD group 3518±203*#0.86±0.10*#AMB+BUD组BUD+ AMB group 2457±176*#△1.23±0.076*#△

2.4 相关性分析结果直线相关性分析

相关性分析结果显示，BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数和淋巴细胞数与肺组织 ROS含量之间均呈正相关，相关系数分别为 0.931、0.898和0.935(均P＜0.05)。

3 讨论

目前认为哮喘的本质是气道慢性炎症，其最有效的抗炎药是糖皮质激素。但临床上有部分患者经糖皮质激素治疗后，病情仍得不到有效控制，说明除了炎症机制外还有其他因素参与了哮喘的发病过程，其中氧化应激(oxidative stress)在哮喘发病中的作用日益受到人们的关注。

研究表明，气道是暴露在高氧化物和抗氧化物环境中的唯一器官。气道中的氧化物主要是活化氧和活化氮(ROS/RNS)。ROS包括过氧化物、过氧化氢及羟自由基等。RNS包括NO及其衍生物。抗氧化物分为抗氧化酶(如SOD家族)和非酶学抗氧化剂(如谷胱甘肽等)。正常状态下，氧化物和抗氧化物保持相对平衡状态，这对保护气道的正常功能是非常必要的。当气道暴露于各种烟尘、细菌、病毒及污染的环境时，这种平衡状态即可被打破，大量ROS不但可导致细胞膜脂质过氧化和蛋白质变性，而且可破坏核酸和染色体，从而引起气道黏膜氧化性损伤。

氧化应激与哮喘的相关性是肯定的，但与哮喘严重程度是否存在相关性目前尚有争议。Nadeem等的研究表明，哮喘患者氧化应激和抗氧化能力与其疾病的严重程度无显著相关性［3］。Picado等的研究发现，除了 GSH－Px外，其它诸如维生素 A、C、E以及锰、锌、硒等均与哮喘严重程度无关［4］。但上述研究均未包括哮喘急性发作期患者。最近Nadeem等对急性发作期患者与稳定期患者进行了比较研究发现，急性发作期患者 MDA比稳定期患者明显增高，总抗氧化能力及蛋白疏基水平比稳定期患者明显降低，而、蛋白羰基、NOX、GSHPx、SOD、CAT及总GSH二者差异无显著［5］。

本研究结果表明，致敏组大鼠肺组织ROS较对照组明显升高，而还原型GSH较对照组明显降低。光镜下观察，致敏组大鼠支气管上皮细胞较对照组明显肿胀、脱落，气道平滑肌层和网状基底膜层增厚，以致管壁增厚，管腔变窄，管壁内及管周有大量以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，而且肺组织ROS水平与BALF中嗜酸粒细胞数及淋巴细胞数均呈正相关。提示氧化应激参与了哮喘的发病过程，氧化应激水平的高低与哮喘严重程度有一定关系。因此，对哮喘急性发作期患者同时给予抗氧化治疗有望成为预防和治疗哮喘的一种方法。

盐酸氨溴索(AMB)是一种较新的粘液溶解剂，近年来许多研究都证明 AMB还有明显的抗氧化的作用。Gillissen等［6］以乙酰半胱氨酸(NAC)和AMB作比较，研究它们清除氧自由基的作用，结果发现二者均可以清除OH－和HOCl，此外AMB还能降低气道高反应性，促进细胞表面活性物质合成。有人用AMB对体外培养的单核细胞及多形核细胞进行干预，发现AMB能直接清除反应性氧化代谢产物，其抗氧化效果可能与炎性细胞的氧化前代谢减弱有关［7］。Teramoto等［8］通过体外实验发现，中性粒细胞产生的过氧化物和 H2O2可以被 AMB以剂量依赖性方式所抑制，其机制尚不清楚，可能与细胞内钙离子浓度改变有关。本研究结果表明，AMB联合BUD干预组大鼠BALF中嗜酸粒细胞数和淋巴细胞数以及肺组织 ROS含量较 BUD组明显降低，而GSH含量明显增加;同时气道炎症损伤程度也较BUD组明显减轻。说明AMB与吸入糖皮质激素对哮喘急性发作具有协同治疗作用。

AMB对哮喘的治疗作用不仅表现在抗氧化方面，其抗炎作用也不能忽视。许多研究表明，AMB能减少炎性介质的释放。Park等［9］研究发现，AMB可抑制人白细胞和肥大细胞释放组织胺、白三烯和细胞因子。Pfeifer等［10］将外周血单核细胞及活化的BALF细胞与不同浓度的AMB一起在体外进行培养，发现AMB干预组细胞培养液中 TNF－a、IL－2及干扰素－a含量较对照组明显降低。说明AMB在体内达到一定浓度时具有明显的抗炎能力，但其作用机制尚不清楚。

综上所述，氧化应激在哮喘的发病中起着重要作用。内源和外源性ROS使机体氧化与抗氧化能力失平衡而产生了氧化应激，不但能促进肺组织局部的炎症反应，而且可削弱糖皮质激素的抗炎效应，是形成顽固性或难治性哮喘的主要原因之一。因此，这类患者在吸入糖皮质激素的基础上，适当加用抗氧化药物治疗有一定益处。

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［3］ Nadeem A，Chhabra SK，Masood A，et al.Increased oxidative stress and altered levels of antioxidants in asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2003，111:72－78.

［4］ Picado C，Deulofeu R，Lleonart R，et al.Dietary micronutrients/ antioxidants and their relationship with bronchial asthma severity. Allergy，2001，56:43－49.

［5］ Nadeem A，Raj HG，Chhabra SK.Increased oxidative stress in acute exacerbations of asthma［J］.J Asthma，2005，42:45－50.

［6］ Gillissen A，Nowak D.Characterization of N2acet ylcysteine andambroxol in anti－oxidant therapy［J］.Respir Med，1998，92 :609－623.

［7］ Gillissen A，Bartling A，Schoen S，et al.Antioxidant function of ambroxol in mononuclear and polymorphonuclear cells in vit ro［J］.Lung，1997，175:235－242.

［8］ Teramoto S，Suzuki M，Ohga E，et al.Effects of ambroxol on spontaneous or stimulated generation of reactive oxygen species by bronchoalveolar lavage cells harvested from patients with or without chronic obstructive pulmonary diseases［J］.Pharmacology，1999，59:135－141.

［9］ Park NH，Han ES，Lee CS，et al.The inhibitory effect of ambroxol on respiratory burst，degranulation and cytosolic Ca2+change in degraded immunoglobulin G－activated neutrophils［J］. Pharmacol Toxicol，1999，84:81－87.

［10］ Pfeifer S，Zissel G，Kienast K，et al.Reduction of cytokine release ofblood and bronchoalveolarmononuclearcellsby ambroxol［J］.Eur J Med Res，1997，2:129－132.

The Effect of Ambroxol Hydrochloride Combined with Budesonide Suspension on Airway Inflammation and Oxidative Stress in Rats with Asthma

ZHOU Na，DU Yong－cheng，ZHANG Xin－ri
(The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ambroxol hydrochloride combined with Budesonide suspension on airway inflammation and levels of oxidative stress in the lung of rats with asthma。MethodsThirty－two male Wistar rats were divided randomly into a control group，a sensitized group，a Budesonide suspension－treated group(BUD)and a group treated by ambroxol hydrochloride combined with Budesonide Suspension(AMB+BUD).The cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of each group was classified and counted.The lung tissue was pathologically observed with hematoxylin and eosin staining，and the levels of ROS and GSH in the lung were measured respectively。ResultsThe number of total cells，lymphocytes and eosinocytes in the BALF as well as the lung tissue ROS levels were significantly lower in AMB+BUD group than in the BUD group(P＜0.05，P＜0.01)，while the lung tissue GSH was significantly higher than that in the BUD group(P＜0.01).Compared with BUD group，the degree of airway inflammatory reaction and pathological damage were significantly weaker in the AMB+BUD group.Linear correlation analysis indicated that there was positive correlation between the level of ROS and the total cell，lymphocyte and eosinocyte counts(P＜0.05)。Conclusions

Oxidative stress plays an important role in the morbility of asthma.Ambroxol，through its anti－inflammatory，antioxidationation，combined with inhaled corticosteroids has a synergistic therapeutic effect on acute asthma attack.

Asthma;Budesonide suspension;Ambroxol hydrochloride;ROS;GSH;Rats

R－33

A

1671－7856(2010)04－0046－04

2010－01－18

周娜(1983－)，女，硕士生，研究方向:哮喘与氧化应激。E－mail:tianya855@163.com。

杜永成，男，院长兼呼吸内科主任，医学博士、教授、博士生导师。E－mail:hxkdyc@yahoo.com.cn。