Meox1在心脏过表达引起转基因小鼠扩张性心肌病

王书美，吕 丹，陈 炜，张 丽，张 伟，张晓娟，曹兴水，张连峰

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

研究报告

Meox1在心脏过表达引起转基因小鼠扩张性心肌病

王书美，吕 丹，陈 炜，张 丽，张 伟，张晓娟，曹兴水，张连峰

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的建立心脏特异表达Meox1转基因小鼠，研究Meox1对心脏发育及心肌病的调节作用。 方法

利用心脏特异启动子α－MHC构建转基因表达载体，显微注射法建立Meox1转基因小鼠，PCR鉴定转基因小鼠的基因型，Western blot检测Meox1在心脏组织中的表达，心脏超声检测转基因小鼠及野生小鼠的心脏结构和功能。结果在生理状态下，Meox1基因只在幼鼠心脏中表达，在病理状态下，Meox1基因在成年心肌病小鼠的心脏组织表达升高。通过显微注射，建立了两个Meox1基因在心脏组织的表达水平明显高于同龄对照小鼠的转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比，两个Meox1转基因小鼠品系收缩期左室内径分别增加7.2%、12.8%(P＜0.01，n =16)，舒张期左室内径分别增加15.6%、24.2% (P＜0.01，n=16)，收缩期容积分别增加36.8%、65.7%(P＜0.01，n=16)，舒张期容积分别增加18.2%、33.8%(P＜0.01，n=16)。射血分数分别减小6.6%、9.3%(P＜0.05，n=16)，短轴内径缩短率分别减小9.4%、12.3%(P＜0.05，n=16)。结论Meox1在心肌病心脏中表达，其在心脏高表达引起心脏左室内径增加，收缩期容积和舒张期容积显著增大，射血分数及短轴缩短率减少等扩张性心肌病表型，是参与心肌病病理发生的基因之一。

Meox1;转基因小鼠;心脏;心脏超声

同源盒蛋白是一组调节组织生长和发育的系统发育保守的转录因子［1］。同源盒基因(homeobox gene)是控制发育的主要基因，对动物的器官发生和细胞分化调控起关键作用。脊椎动物中同源盒基因家族很大，按一个基因组中10万个基因，估计超过0.2%的基因含有同源盒［2］。

Meox基因是一类组成非簇生的、分歧的、控制触角样的同源异形盒基因的亚家族，包括 Meox1 (mesoderm/mesenchyme homeobox gene1)和 Meox2 (mesoderm/mesenchyme homeobox gene 2)，在中胚层和间充质的大范围内广泛表达，编码的蛋白可能在调节体节发育的分子信号网络中发挥作用［3－7］。Meox1在形成体节的前体节中胚层、上皮体节、发育中的体节的生骨节和生皮肌节中表达。但在其他正常组织中也观察到Meox1的表达，包括乳腺和卵巢。Meox2在生骨节，移行至四肢的移行肌原细胞以及四肢的前肌肉区表达［4，7，8］。

Mankoo等［9］报道了同源盒基因 Meox1和Meox2在调节体节形成，图示发育和分化的几种遗传途径中的协调作用。缺乏Meox1活性的小鼠，其椎骨和肋骨有缺陷，而缺乏 Meox2活性的小鼠，其在四肢肌肉的分化和形态发生中严重缺陷。同时缺乏Meox1和Meox2的小鼠缺乏中轴骨骼，并且骨骼肌严重缺陷。这些严重的缺陷表型表明，体节上皮形成、图示发育、边缘的维持、以及生骨节和生皮肌节衍生的细胞分化均需要Meox1和Meox2。

近年来，关于同源盒基因的报道日益增多，然而有关Meox1的研究却很少，通过组织表达谱推测其对心脏发育及心血管系统可能具有重要的生理作用，本文特建立心脏特异表达 Meox1的转基因小鼠，以对其生理功能，特别是其对心脏正常发育可能存在的作用的进行初步研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

C57BL/6J小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，康蓝公司XCXK京2004001，ICR小鼠由本实验室饲养，实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为GC－08－2036。

1.2 实验仪器与试剂

主要仪器:PCR仪(Effendorf)，电泳仪(ATTA)，凝胶 图 象 分 析 系 统 (Tannon)，循 环 水 浴(Pharmacia)，显微注射仪(TE2000U)，电磁搅拌器，低温高速离心机(Beckman)，紫外分光光度计(Amersham)，自动洗片机(Kodak X－OMAT2000)，小动物超声影像系统(Vevo770)。

主要试剂:Trizol试剂、逆转录试剂盒、PCR引物(Invitrogen，美国)，pMD18 T载体、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Sal I和Not I(宝生物工程有限公司，中 国 )，NC 膜 (nitrocellulose membrane，Immobilon NC;Millipore，法国)，羊抗鼠 Meox1蛋白抗体 (Santa Crutz，美国)，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体(Pierce Biotechnology，美国)，内参HRP－GAPDH康成生物，中国)。化学发光试剂(Santa Cruz，美国)。

1.3 模型建立及实验方法

1.3.1 Meox1表达载体的构建及转基因小鼠的制备:Trizol法提取 C57BL/6J小鼠心脏总 RNA，用RT－PCR法扩增小鼠 Meox1全长 cDNA，将扩增片段插入 pMD18T载体，经测序并比对正确无突变碱基后，以 Sal I酶切回收 Meox1片段，并克隆入 α－MHC启动子下游构建心脏特异 Meox1表达载体。提取并酶切鉴定质粒正确后，用 Not I将其线性化，SephedexG50柱纯化 DNA片段，获得 α－MHC启动的 Meox1基因的转基因片段，注射前将转基因片段的浓度调整至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因表达载体注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，用 ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠［10］。

1.3.2 PCR鉴定 Meox1转基因小鼠的基因型:转基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法编号，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA［11］，用PCR法对转基因小鼠进行基因型检测。PCR上游引物为:5’－AAAGAGAGGTCAGACAACCAG－3’，下游引物为: 5’－CAGACTTTGACCTGCCGCTC－3’。PCR反应体系20 μL。反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环。Meox1片段为200 bp。

1.3.3 Western Blot:将小鼠脱颈椎处死后，取 100 mg心脏组织加入1 mL预冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上静置30 min，再将组织匀浆于 4℃12 000 r/min离心 30 min，吸取上清即为心脏组织总蛋白。取50 μg蛋白上样，12% 的SDS－PAGE凝胶电泳，将蛋白转移到 0.45 μm硝酸纤维素NC膜上。将NC膜放入5% 脱脂奶粉封闭液，室温下置摇床上封闭1 h，再用 TBST(1:200)稀释的羊抗鼠 Meox1蛋白抗体，4℃ 杂交过夜。次日，TBST洗3次，每次5 min。将膜转移到 TBST(1:15000)稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体，室温杂交1 h，采用HRP－GAPDH作为内参，TBST洗3次，每次5 min。将膜置于化学发光液中，X－ray胶片曝光、显影及定影。

1.3.4 超声检查Meox1转基因小鼠:选用3月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠，用三溴乙醇(0.2 mL/ 10g体重)麻醉，脱去心前区的被毛，选用30 Hz的探头，按 Zhou报道的方法进行心脏超声影像分析［12］。

1.4 统计学分析

数据SPSS统计软件处理。先进行数据的方差齐性检验，组间比较采用独立性 t检验。计量数据用均数±标准差((x±s)表示。

2 结果

2.1 Meox1基因在小鼠心脏组织中的表达

分别提取出生1周，1月，3月龄野生型小鼠，以及3月龄 cTnTR92Q和 cTnTR141W转基因小鼠［13，14］的心脏组织总蛋白，用Meox1多克隆抗体进行Western blot分析，Meox1仅在1周龄幼鼠心脏中表达，成年小鼠心脏中不表达(图1A)，而在心肌病小鼠模型的心脏中表达(图1B)。

图1 Meox1基因在小鼠心脏组织中的表达A:Expression of Meox1 gene in the heart of wild type mice at different ages detected by Western blot;B:Expression of Meox1 gene in the heart of cTnTR92Qand cTnTR141Wtransgenic mice detected by Western blotFig.1 Expression of Meox1 gene in the heart tissues

2.2 Meox1转基因小鼠的建立及基因型检测

用 RT－PCR法克隆的小鼠 Meox1基因，测序结果表明克隆的 cDNA同已报道的 Meox1序列完全一致(GenBank No.NM_010791.3)，将 Meox1基因插入心脏特异表达的 α－MHC启动子下游，构建 α－MHC－Meox1转基因表达载体(图2A)。用显微注射法将线性化的转基因表达载体注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入受体假孕 ICR小鼠中，小鼠出生14 d提取基因组 DNA，用PCR扩增 Meox1基因200 bp的片段，鉴定Meox1转基因小鼠的基因型(图2B)，共得到7只首建鼠，且均可传代。

图2 Meox1转基因载体和转基因小鼠的PCR鉴定图A:Meox1 transgenic expression construct;B:Genotyping of Meox1 transgenic mice with PCR.Note:M:DL2000 DNA marker;P:positive control using α－MHC－Meox1 plasmid;N:negative control;W:blank control;1－10:genomic DNA samples from transgenic mice.Fig.2 Meox1 transgenic construct and genotyping of Meox1 transgenic mice with PCR

2.3 Meox1基因在转基因小鼠心脏中的表达

分别提取 Meox1首建鼠的 F1代阳性转基因小鼠和同龄阴性对照小鼠心脏组织总蛋白，用 Meox1多克隆抗体进行 Western blot分析，结果显示42号和46号转基因阳性小鼠系心脏组织内 Meox1蛋白表达量明显高于同龄阴性对照小鼠(图3)。这2个系的小鼠用于繁殖并进行心脏功能分析。

图3 Meox 1在转基因小鼠心脏中的表达Note:WT:The wild type mouse control;F042 and F046:The two transgenic lines;GAPDH:Loading normalization.Fig. 3 Expression of Meox1 gene in the heart of transgenic mice

2.4超声检查 Meox1转基因小鼠的心脏几何构型及心功能

将3月龄的Meox1转基因小鼠和同窝阴性小鼠进行心脏超声影像分析(表1)，结果显示，Meox1转基因小鼠(Founder 42，Founder 46)收缩期左室内径(LVID，systolic)分别增加7.2%(P＜0.01，n= 16)和12.8%(P＜0.01，n=16)，舒张期左室内径(LVID，diastolic)分别增加15.6%(P＜0.01，n= 16)和24.2%(P＜0.01，n=16)，收缩期容积(LV volume，systolic)分别增加36.8%(P＜0.01，n= 16)和65.7%(P＜0.01，n=16)，舒张期容积(LV volume，diastolic)分别增加18.2%(P＜0.01，n= 16)和33.8%(WTBX〛P＜0.01，n=16)，射血分数EF(ejection fraction)分别减小6.6%(P＜0.05，n =16)和9.3%(P＜0.01，n=16)，短轴内径缩短率 FS(fraction shortening)分别减小 9.4%(P＜0.05，n=16)和12.3%(P＜0.05，n=16)。

表1 野生型小鼠和Meox1转基因小鼠心脏功能和结构的分析Tab.1 The cardiac structure and function analysis of the wild type and transgenic mice

3 讨论

同源盒蛋白是一组调节组织生长和发育的系统发育保守的转录因子［1］。1984年，McGinnis和Scott等在果蝇控制发育的基因中发现有一些高度保守的序列，这一序列为180 bp，编码的60个氨基酸被称为同源结构域 (Homeodomain)，有螺旋－转角－螺旋(helix－turn－helix)基序(motif)，具有转录因子特征。这些基因因此被称为同源盒基因。随后，从动物和菌物中又陆续克隆了许多含有同源盒并且与发育有关的基因，这些基因既可以是同源盒基因(结构)，也可以被称为同源异型基因(功能)。同源盒基因(homeobox gene)是控制发育的主要基因，对动物的器官发生和细胞分化调控起关键作用。

脊椎动物中同源盒基因家族很大，按一个基因组中10万个基因，估计超过0.2%的基因含有同源盒［2］。传统上同源盒基因分为两个亚家族，一类是成簇排列在染色体上，并按前后轴(antero－posterior，A－P)方式表达，称之为 A－P型，即 Hox基因或I类同源盒基因。HOX基因以4个染色体簇为一系列，各个成员有高度的相似性，胚胎发育中这些基因可能在躯体发育模式中发挥作用。另一类是非 A－P型同源盒基因，非成簇排列，而是散布于不同的染色体上，基于序列的相似性分为一系列组(group)，例如:Emx家族、Pax、Msx和 Otx家族的同源盒基因［3］，一般可能参与特异的器官发生。中胚层/间充质同源盒基因Meox1属于后者。

Meox1是转录因子，表达于发育中的体节，对细胞向骨骼肌系分化起重要作用。Helen等［15］在 P19胚胎癌细胞研究发现Gli2、Meox1、Pax3的调节环对中胚层细胞向肌肉细胞分化是必需的，并且对肌形成调节因子(myogenic regulatory factors，MRFs)的表达及向骨骼肌定性是必需的。

心脏中 Meox1首先在10.5 d.p.c心脏的局部区域表达，这些区域包括躯干动脉(其为大动脉和肺动脉的前身)，以及房室垫(形成隔和瓣膜)［3］。这一器官正在复合生长和重组。Meox1杂交信号未在后期妊娠胚胎成型的心脏中发现。在出生后的小鼠中，Meox1基因也在心脏神经嵴衍生的主动脉升部和主动脉弓表达［16］，也在可能在来源于次级心脏区的主动脉根，肺动脉干以及心瓣膜平面结构表达［17］.我们的结果也显示 Meox1仅在1周龄幼鼠心脏中表达，成年小鼠心脏中不表达(图1A)。

Peter等［18］于 P19胚胎癌细胞建立Meox1过表达的细胞系，研究发现 Meox1可诱导心脏的形态发生。

尽管有关Meox1的研究已有数篇，但其心脏及心血管系统的生物学功能还是所知甚少。我们发现胚胎期表达的基因Meox1在肥厚型心肌病HCM模型中表达上调(图1B)，因此建立了心脏特异的Meox1转基因小鼠。

首建鼠 Founder 42和 Founder 46的后代小鼠PCR检测结果显示外源基因能稳定地传递到下一代。Western blot结果显示Meox1基因的表达量在Founder 42和Founder 46转基因小鼠心脏组织中与野生型小鼠的相比显著增高，表明成功建立了心脏特异高表达的α－MHC－Meox1转基因小鼠，Meox1过表达可使心脏发生心腔变大，室壁不变，心脏收缩功能减弱等改变，对心脏的生长发育有影响。因此，心脏特异表达的 Meox1转基因小鼠的建立，为进一步与心肌病小鼠模型杂交，研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具，为进一步对Meox1在心脏发育和心肌病的发生过程中的生物学功能及可能的机制加以研究，为临床心血管疾病的治疗提供实验依据。

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Over-Expression of Meox1 in Heart Tissue Causes Dilated Cardiomyopathy in the Transgenic Mouse

WANG Shu－mei，LV Dan，CHEN Wei，ZHANG Li，ZHANG Wei，ZHANG Xiao－juan，CAO Xing－shui，ZHANG Lian－feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo establish heart－specific Meox1 expression transgenic mice and to investigate its regulatory effect on the development of heart and cardiomyopathy. MethodsThe transgenic plasmid was constructed by inserting the mouse Meox1 gene into the down－stream of α－MHC promoter.The transgenic mice were generated by microinjection.The genotype of transgenic lines was identified by PCR，and the expression levels of the Meox1 gene were detected by Western blot.The pathologic and functional changes of the heart were analyzed by echocardiography. Results The results of Western blot showed that the expression of Meox1 was only detected in the heart of one－week old wide－type mice，but its expression was up－regulated in the adult mice with hypertrophic cardiomyopathy(HCM).The heartspecific transgenic C57BL/6J mice were established and used to analyze its effect on heart byechocardiography.Compared with the wild type mice，both of the two lines of Meox1 transgenic mice showed significantly heart remodeling with increased left ventricular systolic diameter(7.2%or 12.8% ，P＜0.01，n=16)，increased left ventricular diastolic diameter(15.6%or 24.2%，P＜0.01，n= 16)，increased systolic volume(36.8%or 65.7% ，P ＜0.01，n=16)，and increased diastolic volume(18.2%，33.8% ，P ＜0.01，n=16).Compared with the wild type mice，both of the two lines of Meox1 transgenic mice showed weaker heart function with decreased ejection fraction(6.6%or 9.3% ，P＜0.05，n=16)，and decreased fraction shortening(9.4%，or 12.3% ，P＜0.05，n= 16)。Conclusions The Meox1 is expressed during the pathogenesis of cardiomyopathy.Over－expression of Meox1 in the heart of the transgenic mice causes dilated cardiomyopathy.It suggests that Meox1 may be one of modifier genes which enhances pathogenesis of cardiomyopathy.

Meox1;Transgenic Mouse;Heart;Echocardiography

R－33

A

1671－7856(2010)04－0009－05

2009－12－25

卫生部项目，实验动物和人类疾病动物模型资源扩展(200802036)和十一五新药专项支持(2009ZX09501－026)。

王书美(1985－)，女，硕士生。E－mail:xiaomeiwang6@163.com.。

张连峰，E－mail:zhanglf@cnilas.org