Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系

王杰

(沈阳医学院基础医学院生物化学教研室,辽宁 沈阳 110034)

Fms样酪氨酸激酶 3(Fms-like tyrosine kinase 3,Flt3)是Ⅲ型受体型酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase,RTK)家族成员之一,在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用。Flt3基因突变与急性髓系白血病 (acutemyelogenous leukemia,AML)的发生、预后密切相关。以 Flt3作为靶分子已成为 AML治疗的一种新策略。

1 Flt3基因结构与功能

1.1 结构 人类 Flt3基因又称作胎儿肝脏激酶-2(Fetal liver kinase-2,FLK-2)[1]和人类干细胞激酶-1(human stem cell kinase-1,STK1)[2],位于染色体 13q12,全长约 100 kb,含有 24个外显子,编码 993个氨基酸的蛋白质。Flt3蛋白有分子量为143KD的糖基化高甘露醇形和分子量为 158KD的复合糖形两种形式,前者存在于胞内,经过糖基化过程后形成后者,并定位于膜上。后者是 Flt3在细胞表面的主要存在形式。

Flt3与其它Ⅲ型 RTK如 kit、fms、PDGF受体有相似的结构,包含由胞外区、跨膜区和胞内区 3部分组成。胞外区是胞外配体结合区,由 5个免疫球蛋白样结构域组成;跨膜区有不连续的激酶作用的位点;胞内区为酪氨酸激酶催化区,由 1个胞内近膜结构域 (juxtamembrane domain,JM)、2个被插入结构域分开的激酶结构域 (tyrosine kinase domain,TKD)和 1个 C末端 -结构域构成[3]。近年来的研究表明 JM结构域对维持激酶催化中心空间结构稳定性起主要作用,对激酶活性有负调控作用[4]。

图 1 Flt3信号转导途径

1.2 功能 Flt3在胸腺、肝、脾、淋巴结、胎盘、大、小脑、生殖腺等多种组织中表达。在正常人骨髓中 Flt3的表达仅限于 CD34+干/祖细胞,在红细胞系及成熟 T、B淋巴细胞、NK细胞中无表达[5]。Flt3配体为 FL(Flt3 ligand)。无 FL存在时,近膜结构域对 Flt3二聚体形成和活化起着抑制作用。当 FL与 Flt3受体结合,后者发生二聚体化,激酶结构域的活化环 (activation loop,A-loop)构象发生改变,酪氨酸残基自身磷酸化。激活的 Flt3通过 SHC与 GRB2结合而激活 RAS,从而进一步激活下游的效应因子如 RAF、MAPK/ERK激酶。这些下游效应因子激活核因子 CREB、ELK、STATs,使造血干细胞发生增殖和活化。此外,激活的 Flt3也可以激活 PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)和 RAS途径,导致增殖加快,细胞凋亡抑制[6],见图 1。这两种信号途径通过 RAS的联系提示了 Flt3与白血病发生有关。

2 Flt3基因突变

Flt3基因突变是造成 Flt3基因异常活化的主要原因。其突变形式主要表现为两种：近膜结构域内部串联重复 (internal tandem duplications,ITDs)突变和 TKD或/和 JM的点突变 (pointmutation,PMs)。两种突变均可造成 Flt3酪氨酸激酶的结构性活化,见图 2。

图 2 Flt3基因突变常见类型

Flt3/ITDs是 Flt3基因 AML中最常见的突变类型,常出现在外显子 11,也可累及内含子 11和外显子 12[7]。也有报道 Flt3/ITD位于外显子 14和15,而非外显子 11和 12[8-10]。Flt3/ITDs的插入长度具有多态性,其长度在 3～400bp之间不等,但串联复制的碱基数多是 3的倍数,极少产生框移突变,因而不影响开放阅读框架 (open reading frame,ORF)的正常翻译过程[11,12]。Flt3/ITDs使得 Flt3基因持续活化的原因可能的是：(1)Flt3/ITDs造成了近膜结构域的结构改变,从而破坏了近膜结构域的自我抑制功能[13]。(2)Flt3/ITD突变可以使细胞外的 C末端的构象发生变化,有利于 Flt3二聚体的形成,导致配体非依赖性磷酸化。Flt3因磷酸化而酪氨酶激酶活性增强,导致酪氨酸残基自发激活发生磷酸化作用,激活下游信号通路,如 RAS信号转导途径和转录激活因子 5信号转导途径,促进细胞增殖并与 AML的进展存在密切相关[14],见图 3。

图 3 Flt3基因突变信号转导示意图

在一些无 Flt3/ITDs的 AML患者中也存在配体非依赖性的 Flt3基因组成性激活,说明除 Flt3/ITDs之外,可能还存在有其他类型突变导致 Flt3基因激活。近年来国内外的研究表明约 6.4%～7.7%的患者出现 TKD或/和 JM结构域的点突变,同样可以导致 Flt3基因配体非依赖性激活[15,16]。

TKD点突变,常发生于激酶结构域Ⅱ活化环内,通常为氨基酸残基的突变,插入和缺失,最常见的是 D835是第一个核苷酸 G被 T替代,即D835Y[17]。此外还有 D835V[18]、D835H[19]、D835E[20]、D835N[21]等。最近,在 AML中又发现了两种新的活化环点突变,一种是第 836位 I的缺失,另一种是第 836位 I被 M替换同时被 R插入[22]。这两种新的点突变与 D835一样,突变也位于第 2个酪氨酸激酶的活化环内,都能导致无配体情况下受体自身磷酸化,通过激活 STAT5信号转导途径而抑制白血病细胞的凋亡[23]。

JM点突变发生频率不高,目前尚无大量的临床研究统计学数据。已见报道的突变类型有V579A、V592A、 F594L和 F590GY 591D等[24,25]。研究表明 JM点突变可以降低 JM区对激酶活性负调节作用,从而使 Flt3持续活化并激活下游信号途径,如 STAT5[26]。研究也发现 JM点突变与Flt3/ITDs相比,对细胞的增殖作用较小,且受体自身的活化程度也较弱,推测可能是 JM点突变对近膜结构域的破坏较小,未造成自我抑制功能的完全丧失[27,28]。

3 Flt3基因突变与 AM L

急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤,发病率为 3/10万,其中 AML约占 20%～30%。近几年来,随着环境致癌因素的增加,AML的发病率及死亡率均呈上升趋势。目前 AML的发生机制仍未完全阐明,但随着研究的不断深入,Flt3基因突变在 AML发生、预后中的作用日益受到重视。

3.1 Flt3基因突变与 AML发生 Flt3与其配体FL结合后能通过信号传导途径对造血发育起重要的调控作用,能调节多能造血干细胞、早期前体细胞及不成熟淋巴细胞的生长。1996年,Nakao等首先报道 AML患者 Flt3基因编码的近膜区(JM)存在 Flt3/ITDs[29]。此后的国内外报道显示Flt3基因在 70%～90%的 AML患者细胞中出现异常表达,其中 20%～25%的 AML患者 Flt3基因发生了 Flt3/ITDs,并见于 AML各亚型,其中以 M3和 M 5多见,且突变率各异[30]。我们的研究发现在儿童白血病患者中 Flt3阳性率 80.33%,其中Flt3/ITDs突变率为 17.21%;各亚型突变率分别为 M0 42.86%、M1 22.22%、M2 12.90%、M4 44.44%和 M5 15.38%。说明儿童 AML在外显子11处发生 Flt3/ITDs的频率极高,是儿童 AML发生的主要原因[31]。

目前,Flt3异常表达和基因突变导致 AML发生的分子机制尚不完全清楚。目前大量的临床研究证实 Flt3/ITDs常集于 JM区中从密码子 589～599富含酪氨酸残基的一段区域,从首尾相按顺序插入若干个复制的核苷酸。研究显示在 AML细胞株研究中,Flt3/ITDs可抑制 c/EBPa(repression of CCAAT/estradiol-binding proteinα)和 Pu.1的表达,阻滞髓源细胞分化;应用 Flt3/ITDs抑制剂处理 AML细胞株后 c/EBPαPu.1表达增强[32]。进一步的研究证实 Flt3/ITDs可干扰激酶磷酸化信号通路,使 STAT5(singal transducer and activator of transcrip tion 5)活化增强以及 c/EBPα和 Pu11表达抑制[33]。说明Flt3/ITDs有利于 Flt3二聚体的形成,引起配体非依赖性磷酸化,在 AML的发病机制中起重要作用。

3.2 Flt3基因突变与 AML预后 近年来大量临床研究表明,Flt3/ITDs与 AML预后密切相关。Gale等[30]的结果显示 Flt3/ITDs突变阳性 AML患者与阴性组比较外周血 WBC计数显著增高,CR率显著降低,化疗相关死亡率高,复发危险增高,无病生存率、无事件生存率及总生存率均显著降低。我们采用 PCR方法联合序列检测伴有或不伴有染色体易位的 AML患者 Flt3基因突变情况,结果显示：46例伴有染色体易位患者 Flt3基因表达阳性率 67.39%,其中 Flt3/ITDs阳性率分别为26.09%;伴有染色体易位 Flt3/ITDs阳性患者外周血白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓粒细胞比例虽与不伴有染色体易位 Flt3/ITDs突变阳性患者基本相似,但平均生存时间明显降低,仅为 (8.9±1.5)个月[34]。如 Flt3/ITDs阳性行自异体基因造血干细胞移植的 AML患者无病生存率明显提高[35]。提示 Flt3/ITDs既可作为预测 AML预后的一个重要指标,也可以指导临床治疗。

3.3 Flt3基因突变与 AML微小残留病灶检测 随着急性白血病化疗方案的改善和造血干细胞移植的进展,急性白血病的完全缓解 (CR)率明显提高。然而仍有许多 CR患者在数年内复发,其主要原因是血液学 CR后体内仍残留 106-109白血病细胞,称为微小残留病 (minimal residual disease,MRD)。现在普遍认为 MRD是血液学 CR乃至持续完全缓解 (CCR)期间白血病复发的根源。近年来分子生物学技术的发展,为常规骨髓形态学检查难以检测的 MRD提供了新方法,然而目前尚缺乏合适的 MRD的检测指标。Flt3/ITDs是与AML发生及预后相关的一种重要因子,可望成为MRD检测的重要标志物。

Schnittger等[36]分析1 003例 AML患者,对 34例 Flt3/ITDs阳性患者进行多次检测 Flt3/ITDs后认为大部分患者 Flt3/ITDs为唯一可检测的标志,且与临床阶段、FISH、PCR结果有较好的相关性,4例复发患者检测 Flt3/ITDs比其他方法提前 2～3个月检测到复发,认为 Flt3可作为 MRD检测标志。我们用 Flt3基因作为 AML的分子标志,通过PCR技术跟踪了 AML完全缓解后的 MRD,结果表明：PCR技术检测 Flt3基因的最低检出值为 100 pg;Flt3基因阳性 AML患者,经标准治疗后,半数左右的患者达到 CR,其中绝大部分患者 Flt3基因表达减弱或转为阴性;AML患者达 CR后 Flt3基因表达持续阳性或转阴后再次出现阳性,提示将发生复发[37]。说明在完全缓解期追踪检测 Flt3并分析其变化极为重要,Flt3转为阴性或长期持续阴性者预示能获得长期无病生存。

4 结语

Flt3基因突变是 AML中最常见的基因异常,与 AML发生有着密切关系。Flt3/ITDs有望成为一种新的生物标志物,用于 AML预后不良和 MRD判定,并可能成为 AML治疗的新靶点。

[1]Rosnet O,Marchetto S,deLapeyriere O,et al.Murine Flt3,a gene encoding a novel tyrosine kinase receptor of the PDGFR/CSF1R fam ily[J].Oncogene,1991,6：1641-1650.

[2]Matthews W,Jordan CT,Wiegand GW,et al.A receptor tyrosine kinase specific to hematopoietic stem and progenitor cell-enriched populations[J].Cell,1991,65：1143-1152.

[3]Abu-Duhier FM,Goodeve AC,Wilson GA,et al.Genom ic structure of human Flt3：implications formutationalanalysis[J].Br J Haematol,2001,113：1076-1077.

[4]Griffith J,Back J,Faerman C,et al.The structural basis for auto inhibition of Flt3 by the juxtamembrane domain[J].Mol Cell,2004,30：169-178.

[5]Sargin B,Choudhary C,Crosetto N,et al.Flt3-dependent transformation by inactivating c-Cbl mutations in AML[J].Blood,2007,110(3)：1004-1012.

[6]Wang Jie,Wang Tong,Li Shu,et al.Flt3/ITD mutation in pediatric leukemia and its clinical significance[J].Chinese Journal of Cancer,2007,26(1)：58-63.

[7]ChenW,Huang Q.Detection of Flt3/ITD,JAK 2(V617F)and NPM 1 gene mutations in chronic myelomonocytic leukemia[J].Leuk Res,2009,33(11)：207-209.

[8]Huang Q,ChenW,Gaal KK,et al.A rapid,one step assay for simultaneous detection of Flt3/ITD and NPM 1 mutations in AML with normal cytogenetics[J].Br J Haematol,2008,142(3)：489-492.

[9]Meshinchi S,Stirewalt DL,Alonzo TA,et al.Structural and numerical variation of Flt3/ITD in pediatric AML[J].Blood,2008,111(10)：4930-4933.

[10]Meshinchi S,Appelbaum FR.Structuraland functional alterations of Flt3 in acutemyeloid leukem ia[J].Clin Cancer Res,2009,15(13)：4263-4269.

[11]Hasan SK,Sazawal S,Dutta P,et al.Impactof Flt3 internal tandem duplications on Indian acute promyelocytic leukemia patients：prognostic implications[J].Hematology,2007,12(2)：99-101.

[12]Gale RE,Green C,Allen C,et al.The impact of Flt3 internal tandem duplication mutant level,number,size,and interaction with NPM 1mutations in a large cohort of young adult patientswith acutemyeloid leukemia[J].Blood,2008,111(5)：2776-2784.

[13]Kim KT,Baird K,Davis S,et al.Constitutive Fms-like tyrosine kinase 3 activation results in specific changes in gene expression in myeloid leukaemic cells[J].Br J Haematol,2007,138(5)：603-615.

[14]Sallmyr A,Fan J,Datta K,et al.Internal tandem duplication of Flt3(Flt3/ITD)induces increased ROS production,DNA damage,and misrepair：implications for poor prognosis in AML[J].Blood,2008,111(6)：3173-3182.

[15]Kang HJ,Hong SH,Kim IH,et al.Prognostic significance of Flt3mutations in pediatric non-promyelocytic acutemyeloid leukemia[J].Leuk Res,2005,29(6)：617-623.

[16]Grundler R,Miething C,Thiede C,et al.Flt3-ITD and tyrosine kinase domain mutants induce-distinct phenotypes in a murine bone marrow transplantation model[J].Blood,2005,105(12)：4792-4799.

[17]Yamamoto Y,Kiyoi H,Nakano Y,et al.Activating mutation of D 835 within the activation loop of Flt3 in human hematologicmalignancies[J].Blood,2001,97(8)：2434-2439.

[18]Lu Y,K itaura J,Oki T,et al.Identification of TSC-22 as a potential tumorsuppressor thatis upregulated by Flt3-D 835V but not Flt3-ITD[J].Leukem ia,2007,21(11)：2246-2257.

[19]Scholl S,Krause C,Loncarevic IF.Specific detection of Flt3 pointmutationsby highly sensitive real-time polymerase chain reaction in acute myeloid leukem ia[J].J Lab Clin Med,2005,145(6)：295-304.

[20]Reindl C,Spiekermann K.From kinases to cancer：leakiness,loss of autoinhibition and leukemia[J].Cell Cycle,2006,5(6)：599-602.

[21]Neben K,Schnittger S,Brors B,et al.Distinct gene expression patterns associated with Flt3-and NRAS-activatingmutations in acute myeloid leukem ia with normal karyotype[J].Oncogene,2005,24(9)：1580-1588.

[22]Taketani T,TakiT,Sugita K,et al.Flt3mutations in theactivation loop of tyrosine kinase domain are frequently found in infant ALL with MLL rearrangements and pediatric ALL with hyperdip-loidy[J].Blood,2004,103(3)：1085-1088.

[23]Smith CA,Fan G.The saga of JAK 2mutations and translocations in hematologic disorders：pathogenesis,diagnostic and therapeutic prospects,and revised World Health Organization diagnostic criteria formyeloproliferative neoplasms[J].Hum Pathol,2008,39(6)：795-810.

[24]Meshinchi S,Alonzo TA,Stirewalt DL,et al.Clinical implications of Flt3mutations in pediatric AML[J].Blood,2006,108(12)：3654-3661.

[25]Stirewalt DL,Meshinchi S,Kussick SJ,et al.Novel Flt3 point mutations within exon 14 found in patients with acutemyeloid leukaemia[J].Br JHaematol,2004,124(4)：481-484.

[26]Vempati S,Reindl C,Wolf U,et al.Transformation by oncogenic mutants and ligand-dependent activation of Flt3 wild-type requires the tyrosine residues 589 and 591[J].Clin Cancer Res,2008,14(14)：4437-4445.

[27]Reindl C,Bagrintseva K,Vempati S,etal.Pointmutation in the juxtamembrane domain of Flt3define anew classof activatingmutations in AML[J].Blood,2006,107(9)：3700-3707.

[28]Mattison RJ,Ostler KR,Locke FL,et al.Implications of Flt3 mutations in the therapy of acute myeloid leukemia[J].Rev Recent Clin Trials,2007,2(2)：135-141.

[29]Naoe T,K iyoi H.Normal and oncogenic Flt3[J].CMLS,2004,61(23)：2932-2938.

[30]Gale RE,Hills R,Kottaridis PD,et al.No evidence that Flt3 status should be considered asan indicator for transplantation in acutemyeloid leukemia(AML)：ananalysis of 1135 patients,excluding acute promyelocytic leukemia,from the UK MRC AML10 and 12 trials[J].Blood,2005,106(10)：3658-3665.

[31]王杰,王彤,李树,等.儿童白血病患者Flt3/ITD突变分析及其临床意义 [J].癌症,2007,26(1)：58-63.

[32]Zheng R,Friedman AD,LevisM,et al.Internal tandem duplication mutation of Flt3blocksmyeloid differentiation through supp ression of C/EBPαexpression[J].Blood,2004,103：1883-1990.

[33]Choudhary C,Schwable J,BrandtsC,etal.AML-associated Flt3 kinase domainmutations show signal transduction differences compared with Flt3 ITD m tltaticons[J].Blood,2005,106,265-273.

[34]王杰,李树,王彤.伴有染色体异常白血病患者Flt3基因检测的临床意义 [J].中国实验血液学杂志,2007,15(4)：700-704.

[35]王彤,王杰.白血病患者 Flt3基因突变及其与白血病发生、预后的关系检测 [J].中国组织工程研究与临床康复杂志,2007,11(37)：7509-7512.

[36]Schnittger S,Schoch C,DugasM,et al.Analysis of Flt3 length mutations in 1003 patients with acutemyeloid leukem ia：correlation to cytogenetics,FAB subtype,and prognosis in the AML CG study and usefulness asa marker for the detection ofm inimal residual disease[J].Blood,2002,100(1)：59-66.

[37]李树,王彤,王杰,等.Flt3基因动态监测在急性髓系白血病治疗中的应用 [J].中国实验血液学杂志,2007,15(4)：705-708.