体外DCs在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用机制①

刘金鹏 邓春艳 齐 晖 李富荣 (暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院临研中心,深圳518020)

体外DCs在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用机制①

刘金鹏 邓春艳 齐 晖 李富荣 (暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院临研中心,深圳518020)

目的:探讨树突状细胞(dendritic cells,DCs)在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中所发挥的作用,从而阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的机制。方法:采用DCs的常规诱导方法(rmG M-CSF、IL-4和LPS),在诱导过程中加入不同剂量的抗CD45RB抗体,成熟后利用流式细胞仪检测细胞表型、周期和吞噬能力,ELISA法检测IL-12分泌量,混合淋巴细胞培养检测DCs对T细胞增殖能力的影响。结果:DCs经抗CD45RB抗体处理后,CD11C和CD83表达升高,CD86表达下降,自身增殖和吞噬能力增强,但分泌IL-12和刺激T细胞增殖的能力明显下降。结论:耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,tDCs)能显著抑制T细胞的增殖,它的产生是抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的主要机制之一。

抗CD45RB抗体;树突状细胞;免疫耐受

目前已有大量实验证明,抗CD45RB抗体能够在同种异体移植模型中诱导移植物长期存活,并在受体体内形成特异性的免疫耐受[1-3],Deng等[4]还发现抗CD45RB抗体诱导的耐受状态有其特殊性,它需要受体B淋巴细胞和完整的胸腺,胸腺来源的调节性T细胞将耐受从胸腺转向外周,而DCs在T细胞和B细胞的发育、分化中,以及记忆T细胞和B细胞的形成和维持中发挥着重要的作用,那么抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受体系中DCs有何作用,目前还没有相关报道。本实验就DCs在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中如何发挥作用,利用在骨髓细胞来源DCs的分化中加入不同剂量的抗CD45RB抗体,观察抗CD45RB抗体对BMC来源mDCs在形态、表型、细胞周期、吞噬能力以及分泌IL-12能力上的变化,再通过混合淋巴细胞培养体系模拟同种异体移植排斥反应来分析mDCs的免疫学功能,以阐明DCs在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用,为抗CD45RB抗体的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周雌性C57BL/6小鼠购自南方医科大学,6～8周雄性BALB/c小鼠购于广东省实验动物中心,均饲养在SPF级动物实验室(暨南大学第二临床医学院实验动物中心)。

1.2 DCs的诱导 无菌提取C57BL/6小鼠的股骨和胫骨,用RPMI1640培养基(Thermo,America)冲出髓腔内的骨髓细胞,然后用淋巴细胞分离液分离出单核细胞,加入完全培养基(含10%fetal calf serum, rmG M-CSF和IL-4各10 ng/ml,PeproTech,USA),细胞浓度为1×106个/ml,37℃,5%CO2培养2天后弃悬浮细胞,加完全培养基继续培养;第4天半量换液,加刺激剂LPS 1μg/ml(Sigma,USA),第6天收获mDCs为对照组;在完全培养基里分别添加不同剂量的抗CD45RB抗体(5、10、20和40μg/ml,克隆号: Cat.#BE0019,BioXcell,Lebanon)收获的mDCs为实验组。

1.3 mDCs表型的检测 收获各组mDCs,将其浓度调整为1×106个/ml,分别取100μl细胞悬液,加入FITC(Fluorescein isothiocyanate)-CD11C和 FITC-I-Ab (BD Pharmingen,America),PE(phycoerythrin)-CD83和PE-CD86(eBioscience,USA)及相应的 Isotype,37℃避光孵育15～20分钟,流式细胞仪(Epics ALTRA型, American)检测其细胞表型。

1.4 mDCs细胞周期检测 将各组mDCs细胞悬液移入离心管,1 200 r/min离心5分钟,弃上清,用PBS洗涤细胞两遍,然后用70%乙醇固定细胞,4℃过夜;用PBS洗涤2次后用0.4 ml PBS重悬,加入RNase-A 20μl(1mg/ml,G ibco,America)37℃作用30分钟,再加入碘化丙啶 50μl(0.5 mg/ml,Sigma, America)中,避光冰浴30分钟后,流式细胞仪检测以multicycle analysis软件分析。

1.5 mDCs吞噬抗原能力的检测 将各组mDCs用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬,取5×105个细胞,加入FITC-Dextran至终浓度1 mg/ml(Molecular Probs,America),混匀后分为两管,一管置于4℃作为空白对照,另一管置于37℃检测内吞能力,孵育2小时后用冰PBS液洗涤2次,流式细胞仪进行分析,以平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)表示DCs摄取Dextran的能力。DCs内吞量=DCs内吞平均荧光强度-DCs对照平均荧光强度。

1.6 mDCs分泌IL-12的检测 取各组mDCs的培养上清液,小鼠IL-12 ELISA试剂盒(Biosource,American)检测分泌IL-12的含量。

1.7 DCs和T细胞的分选 将各组mDCs和BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液,用全DC细胞磁珠和T细胞免疫磁珠(Miltenyi Biotec,Germany)分选DCs和T淋巴细胞,用流式细胞仪检测其纯度。

1.8 混合淋巴细胞反应(MRL) mDCs经丝裂霉素处理后作为刺激细胞,按4×104个/孔加入96孔板,再加入提取的T细胞(2×105个/孔)作为反应细胞,对照组则只加入BALB/c小鼠T细胞(2×105个/孔),然后补加10%FBS的RPMI1640至每孔终体积200μl,37℃、5%CO2培养箱培养3天,然后用CCK-8 ELISA试剂盒(DojinDo,Japan)检测各组的吸光度(OD值)。每组均设3个复孔。

1.9 统计学处理 全部数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,所有结果以 x—±s表示,采用方差分析或 t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCs形态学观察 培养至第2天,细胞开始分为悬浮和贴壁两种状态,聚集成簇,大部分细胞形态规则,少量细胞已有毛刺出现;培养至第4天细胞数量开始增多,悬浮和贴壁细胞的比例为1∶1左右,体积较大且形态不均,大部分细胞已有毛刺样突起;第6天,细胞的毛刺样突起更加明显(图1),但是镜下对照组和实验组的mDCs细胞在形态和数量上无明显差别。

图1 DCs的毛刺样突起更为明显(×200)Fig.1 The dendritic projections were more obviously(×200)

图2 不同剂量的抗CD45RB抗体对DCs表型的影响Fig.2 Effect of different dosage of anti-CD45RB monoclonal antibody on the phenotype of DCs

2.2 mDCs表型的检测 检测mDCs表面的主要表型(CD11C、CD83、CD86和I-Ab),结果如图2,发现实验组加入各剂量抗CD45RB抗体的mDCs表面CD11C表达均高于对照组(P<0.05),而10μg/ml剂量组CD11C的表达明显高于其它各剂量组(P<0.05)。CD83表达结果类似,实验组明显高于对照组(P< 0.05),实验组中的10μg/ml剂量组CD83的表达最高(P<0.05),5μg/ml和20μg/ml剂量组间CD83的表达无差异(P>0.05),但均高于40μg/ml组(P<0.05)。实验组中CD86的表达要显著低于对照组 (P<0.05),且实验组中的20μg/ml和40μg/ml剂量组低于5μg/ml和10μg/ml剂量组(P<0.05)。I-Ab的表达不受加入抗体剂量的影响,实验组与对照组无差异(P>0.05)。

2.3 mDCs细胞周期检测 实验组处于G2-M期的细胞数明显多于对照组(P<0.01),但是实验组中的5、10和20μg/ml三个剂量组之间处于G2-M期的细胞数无明显差异(P>0.05,图3)。

2.4 mDCs摄取抗原能力的检测 实验组中5、10和20 μg/ml三个剂量组的抗原吞噬能力无差异(P>0.05),但与对照组相比,三个剂量组的抗原吞噬能力为对照组的6～8倍(图4),具有显著性差异(P<0.01)。

图3 DCs细胞周期的检测Fig.3 Determine of cycle of DCs

图4 DCs抗原摄取能力的检测Fig.4 Determine of phagocytic function of DCs

2.5 mDCs分泌IL-12水平 实验组IL-12分泌量明显低于对照组(P<0.01),实验组中5、10和20μg/ml三个剂量组IL-12的分泌量依次降低,且存在显著性差异(P<0.01),20μg/ml剂量组的IL-12分泌量只有对照组的1/3(图5),说明抗体加入量与mDCs分泌IL-12的能力呈明显的负相关性。

2.6 混合淋巴细胞反应 实验分为三组:①mDCs+ T;②DCs(10μg)+T;③单独T细胞组(设零组)。结果如图6,①组的OD值明显大于②组(P<0.01),说明经抗CD45RB抗体处理后的DCs具有明显抑制T增殖的能力。

3 讨论

图5 各组上清液IL-12的含量(pg/ml)Fig.5 IL-12 activity in the supernatant of different groups (pg/ml)

图6 混合淋巴细胞反应Fig.6 Mixed lymphocyte reaction

以往认为DCs是激活T细胞初始免疫反应的细胞,随着人们认识逐渐深入,发现DCs参与免疫耐受的诱导,并提出tDCs这一概念。tDCs具有以下几种特性:①表面缺乏免疫应答所必需的CD40、CD80和CD86等共刺激分子,不能有效递呈抗原和激活T细胞,导致免疫耐受;②能够诱导外周T细胞的无能或低能反应,并激活T细胞凋亡;③诱导调节性T细胞(regulator T cell,Treg cell)和Th2细胞的产生,从而引起特异性免疫耐受。而抗CD45RB抗体在体外诱导的免疫耐受可能与tDCs有关。本研究结果发现,经抗CD45RB抗体处理后,mDCs表面共刺激分子CD86的表达下降,而且mDCs的特异性标记CD11C和成熟标记CD83表达升高。CD86的表达下降说明mDCs递呈抗原和激活 T细胞的能力降低[5]。而CD11C表达升高可能是抗CD45RB抗体增强细胞内物质积累,使更多mDCs进入分裂期。CD83升高说明mDCs可能与胸腺中T细胞和B细胞之间的相互作用得到了加强,因为CD83分子和其分泌的可溶性CD83分子可与胸腺中T细胞和B细胞表面的CD83配体结合,使T细胞和B细胞的发育和分化受到影响[6-9]。一些学者报道CD83表达升高不影响mDCs刺激T细胞增殖能力,但可引起可溶性CD83分子的增多[10,11]。可溶性CD83分子可使T细胞增殖能力受到明显抑制使其移植物的长期存活[12,13]。由此可见,经抗CD45RB抗体处理后,mDCs不但激活T细胞的能力受到抑制,而且自身数量以及分泌的耐受性可溶性CD83分子增多,将有利于机体免疫耐受的产生。

目前研究认为,DCs之所以能够导致免疫耐受的发生,还依赖于它本身具有一些未成熟阶段的生物学功能,如吞噬抗原能力增强和分泌IL-12能力下降等。对Ab-mDCs的功能经Dextran内吞实验和IL-12含量测定发现,抗CD45RB抗体能够使实验组mDCs的抗原吞噬能力显著增强,而IL-12分泌能力受到显著抑制。IL-12作为DCs抗原提呈和活化T细胞过程中最为重要的细胞因子[14],它的减少使初始T细胞更易向Th2细胞转化,引起IFN-γ分泌减少、IL-10分泌增加,进而诱导T细胞“无反应”和免疫耐受的发生。

IL-4是促使DCs成熟的生长因子,如果在DCs的诱导过程中不添加IL-4,就会诱导出具有免疫耐受性的DCs,它能够抑制同种异体移植物的排斥,引起免疫耐受的形成。而本实验中加入了IL-4促使DC成熟,所以诱导的mDCs能够刺激T淋巴细胞增殖,由于实验组又添加了抗CD45RB抗体,结果mDCs刺激T淋巴细胞增殖的能力明显受到抑制,这就说明抗CD45RB抗体可以使mDCs获得免疫耐受性。

综上所述,抗CD45RB抗体能够成功的诱导出一种tDCs,它具有显著抑制T细胞增殖的能力。但tDCs是否可以引起移植物的长期存活,以及耐受动物体内是否存在这种tDCs,还有待进一步体内实验的研究证实。

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11 Wolenski M,Cramer S O,Ehrlich Set al.Enhanced activation of CD83-positive T cells[J].Scand J Immunol,2003;58(3):306-311.

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13 Xu J F,HuangBJ,Y in Het al.A limited course of soluble CD83 delays acute cellular rejection of MHC-mismatched mouse skin allografts[J]. Transpl Int,2007;20(3):266-276.

14 Kadowaki N.Dendritic cells:a conductor of Tcell differentiation[J].Allergol Int,2007;56(3):193-199.

[收稿2009-10-09 修回2009-11-16]

(编辑 倪 鹏)

The role of DC in anti-CD45RB antibody-induced immune tolerance

LIU Jin-Peng,DENG Chun-Yan,QI Hui,LI Fu-Rong.Clinical Research Center,Shenzhen People’s Hospital,the Second Medical College of University of Jinan,Shenzhen518020,China

Objective:T o investigate the role of dendritic cells(DCs)in the anti-CD45RB antibody-induced immune tolerance,and the mechanism of immune tolerance induced by anti-CD45RB antibodies.Methods:DCs were induced by conventional methods(rmG M-CSF,IL-4 andLPS),different dosesof anti-CD45RB antibodieswere added in the induction process.Then,mature cellswere harvested,andflow cytometry (FCM)was used to determine cell phenotypes,cycle and phagocytosis,ELISA method was performed to examine the concentration of IL-12 and the ability of T cell proliferation was observed by mixed lymphocyte culture.Results:The DCs preparation was shown a high expression of CD11C and CD83,a low expression of CD86,with strong proliferative and phagocytic capacity after treated with anti-CD45RB antibody.Its secretion of IL-12 was decreased,and it could less effectively stimulate T cell proliferation after treated with anti-CD45RB antibody.Conclusion: One of the mechanismsof anti-CD45RB monoclonal antibody-induced tolerance is to generate tolerogenic dendritic cells(tDCs),significantly inhibiting the proliferation of T cells.

Anti-CD45RB antibody;Dendritic cell;Immune tolerance

R392.4 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2010)02-0113-04

①本文为国家自然科学基金资助项目(No.30772042)

刘金鹏(1982年-),男,在读硕士,主要从事干细胞与组织工程研究,E-mail:lekai0822@163.com;

及指导教师:李富荣(1962年-),男,博士,研究员,主要从事干细胞和细胞移植方面的研究,E-mail:frli62@ yahoo.com。