卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0真核表达载体的构建及表达鉴定

冯燕梅 罗永艾 江 涛 韩晓黎 彭 丽 吴玉蓉

(重庆医科大学附属第一医院呼吸内科,重庆400016)

卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0真核表达载体的构建及表达鉴定

冯燕梅 罗永艾 江 涛 韩晓黎 彭 丽 吴玉蓉

(重庆医科大学附属第一医院呼吸内科,重庆400016)

目的:构建卡氏肺孢子菌p55-v3及p55-v0抗原基因真核表达载体,mRNA水平鉴定其在COS-7细胞中的表达。方法:以卡氏肺孢子菌总RNA为模板,RT-PCR技术扩增p55-v3及p55-v0抗原基因,连接至pTA2载体,再克隆到pVAX1真核表达载体,构建重组质粒pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0。重组质粒在感受态DH5α大肠杆菌中大量扩增后,转染至COS-7细胞, RT-PCR鉴定其在mRNA水平的表达。结果:构建的重组质粒经酶切及测序鉴定,与文献报道的同源性分别达到99.8%和99.9%;其编码的氨基酸与文献报道的同源性为100%。RT-PCR显示p55-v3和p55-v0成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。结论:本研究成功构建了pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步阐明p55-v3的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究提供了基础。

卡氏肺孢子菌;p55-v3及p55-v0;真核表达

卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)是一种涉及人和多种哺乳动物的机会感染性真菌,其中感染人的卡氏肺孢子菌已经更名为耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci,PC),它所引起的耶氏孢子菌肺炎(Pneumocystis jirovecipneumonia,PCP)是各种先天或后天免疫机能低下的患者(如艾滋病、器官移植、肿瘤放化疗等)常见的并发症和主要的死亡原因之一。近年来,由于艾滋病患者人数增加及免疫抑制剂的应用增多,PCP的发病率呈上升趋势。因此,及时有效预防和治疗PCP并进行相关的基础研究具有重要的意义。

大鼠源P55抗原蛋白分子量为45～55 kD,它是在早期感染肺孢子菌的大鼠呼吸道中发现的一种明显的抗原组分,能够刺激机体产生保护性免疫反应[1,2]。近年来,Ma等[3]研究发现p55抗原基因存在多样性,他们分别克隆了p55-v1～v4,其中p55-v3与Smulian[4]克隆的p55-v0结构上存在差异,并且定位于不同的染色体上。由于其结构和位置的不同,推测机体在感染PC的过程中,p55-v3和p55-v0刺激宿主免疫反应时可能发挥了不同的作用。本文通过对上述两种抗原基因进行扩增、克隆、序列分析,并在COS-7细胞中对其表达效率进行研究,有利于进一步阐明p55-v3的免疫保护功能,从而为阐明PC与宿主相互作用的分子机制及新型疫苗的研制提供基础,为PCP防治提供一种新的方法和手段。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。RNAisoTMPlus,RT-PCR试剂盒(两步法),限制性内切酶 K pnⅠ、ApaⅠ及T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司;DNA胶回收试剂盒及Bio MarkerⅢ购自BioFlux公司;PCR纯化试剂盒购自北京盖宁生物科技有限公司;其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 动物模型 根据文献[5]报道清洁级雌性SD大鼠,体重200克左右(由重庆医科大学动物实验中心提供),注射地塞米松诱导PCP,建立动物模型。

1.3 质粒、菌株及细胞 TA rget cloneTM-Plus-购自TOY OBO公司。真核表达载体pVAX1购自Invitrogen公司。感受态大肠杆菌DH5α购自北京鼎国生物技术有限公司。COS-7细胞由重庆医科大学生命科学院提供。

1.4 引物的设计和合成 根据p55-v0和p55-v3的基因序列CDS区设计引物。运用Primer5.0和Oligo6.0分析引物的可行性,用Blastn对其同源性进行

1.5 总RNA的提取 取病原学确诊的重度PC感染的肺组织约50 mg,按RNAisoTMPlus试剂说明书抽提总RNA。用核酸蛋白定量检测仪测定RNA浓度及OD260/OD280,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。

1.6 p55-v3和p55-v0基因扩增及亚克隆 按照试剂盒说明书进行两步法RT-PCR反应,反应体系为50μl。p55-v3及p55-v0反应条件均为94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,55℃延伸30秒,72℃延伸60秒,共35个循环。最后72℃延伸5分钟。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物按胶回收试剂盒说明书进行胶回收后与T载体连接。PCR产物2μl,pTA2 vector 1μl,2×ligation Buffer 5μl,T4 DNA Ligase 1μl,双蒸水补足10μl,室温反应30分钟。然后用制备好的感受态大肠杆菌DH5α进行转化。将10μl连接液加入感受态细胞(200μl)中轻轻混匀后冰浴30分钟,42℃热休克30秒,冰浴冷却2分钟。加SOC培养基900μl,于37℃振动培养1小时。取适量涂于LB/AP/IPTG/X-gal板上,于37℃过夜培养。通过蓝白判定挑出白色重组菌落接种于抗Amp的LB培养液中37℃,200 r/min震荡培养12小时。次日取1μl菌液PCR鉴定(条件同前),同时用质粒抽提试剂盒抽提质粒后用K pnⅠ及ApaⅠ进行酶切鉴定。取阳性重组质粒送sangon测序鉴定并运用DNAstar软件分析测序结果。

1.7 真核表达载体的构建及鉴定 分别将测序正确的重组载体pTA-p55-v3、pTA-p55-v0及pVAX1用K pnⅠ及ApaⅠ进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后运用胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒回收大小分别约1 054 bp、1 253 bp及3 000 bp的DNA片段。分别将酶切后的p55-v3、p55-v0与回收的pVAX1片段用T4 DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,运用卡那霉素(50μg/ml)作为抗性阳性筛选,挑取阳性克隆扩增并小量提取质粒DNA。对质粒DNA进行PCR、双酶切及测序鉴定。

1.8 转染COS-7细胞并检测目的基因mRNA的表达COS-7细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEMF12中,于转染前24小时收集细胞并接种于50 ml培养瓶中,细胞密度为3×105ml-1,在37℃,5%CO2条件下培养24小时,使每瓶细胞密度达到90%左右。与此同时根据无内毒素质粒抽提试剂盒说明书抽提质粒pV AX-p55-v3、pV AX-p55-v0及pV AX1,然后运用LipofectamineTM2000转染所抽提质粒,转染后24小时运用RT-PCR法检测目的基因mRNA的表达,目的基因及内参(G APDH)PCR条件同前。

2 结果

2.1 PC总RNA的提取 提取的总RNA经核酸蛋白定量检测仪测定浓度为 2.045μg/μl,OD260/ OD280为1.937,1%琼脂糖凝胶电泳5S、18S、28S三条带均可见(图1),说明总RNA达到实验要求,可以进行RT-PCR。

2.2 p55-v3和p55-v0基因的克隆 以PC总RNA的反转录产物cDNA为模板,分别加入特异性引物P1、P2和P3、P4,所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析分别在1200bp、1000bp左右处可见一特异性条带,与预期大小相符(图2)。将片段克隆入pTA2载体,获得阳性重组克隆pTA-p55-v3、pTA-p55-v0,PCR及双酶切鉴定结果所得质粒为重组载体(图3、图4)。经测序及DNAstar软件分析所得两个重组载体分别为p55-v3、p55-v0抗原基因片段,p55-v0两个碱基发生突变,210位C-G、475位A-G。p55-v3一处碱基发生突变,1 021位T-C,与文献报道的同源性分别达到99.8%和99.9%;其编码的氨基酸与文献报道的同源性为100%。而p55-v3和p55-v0之间的同源性为20.9%。

图1 PC感染鼠肺组织总RNAFig.1 Total RNA of lung tissues from PC infected rat

图2 p55-v0及p55-v3基因RT-PCR扩增产物的鉴定Fig.2 Identification of RT-PCR product of p55-v0 and p55-v3 gene

2.3 pV AX1-p55-v3和pV AX1-p55-v0真核表达载体的构建 将pT A-p55-v3、pT A-p55-v0重组质粒用K pnⅠ、ApaⅠ双酶切,获得p55-v3、p55-v0抗原基因片段,再将其克隆至真核表达载体pV AX1,构建重组载体pV AX-p55-v3、pV AX-p55-v0,经酶切鉴定表明p55-v3、p55-v0抗原基因片段已成功克隆入pV AX1载体(图5)。

2.4 RT-PCR鉴定重组载体在COS-7细胞中的表达

pVAX-p55-v0、pVAX-p55-v3及空质粒转染COS-7细胞后24小时,提取总RNA,进行RT-PCR,1%琼脂糖凝胶电泳观察(图6)可见重组质粒转染组(泳道1、2)有明显的特异性条带,分别位于1 200 bp及1 000 bp左右,其大小与p55-v0及p55-v3基因片段一致,而空质粒转染组仅见内参(G APDH)条带,未见特异性条带。表明重组质粒转染组的p55-v0及p55-v3基因在COS-7细胞中有表达。

图3 重组质粒pTA-v0、pTA-v3的PCR鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pTA-v0/pTA-v3 by PCR

图4 重组质粒pT A-v0、pT A-v3的KpnⅠ、ApaⅠ双酶切鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pTA-v0/pTA-v3 digested with KpnⅠand ApaⅠ

图5 重组真核表达载体pVAX-p55-v3、pVAX-p55-v0的酶切鉴定Fig.5 Identification of recombinant eukaryotic expression vector pVAX-p55-v3,pVAX-p55-v0 by enzyme digesting

图6 转染COS-7细胞mRNA水平的表达Fig.6 mRNA expression of the transfected COS-7 cells

3 讨论

PC免疫诊断和免疫预防、治疗的关键问题是抗原。而由于PC培养困难,很难成批供应大量高纯度的PC抗原蛋白,同时由于PC抗原成分复杂,抗原变异较大,因此利用DNA重组技术制备大量高纯度抗原,对于免疫诊断、预防和治疗均具有重要意义。

P55是卡氏肺孢子菌细胞壁上的一种组分抗原。Smulian等[2,4]克隆并鉴定了肺孢子菌55 kD抗原基因(p55-v0),将重组P55-V0抗原主动免疫大鼠后能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应。Ma等[3]克隆了p55-v3基因(GenBank:AY768940),通过比较发现p55-v3和p55-v0基因5′端存在较大差异,3′端均为高度保守区域但两者重复区域的氨基酸种类和数目存在差异;p55-v0包含一个N-连接糖基化位点和RG D连接位点而p55-v3却没有;同时染色体杂交发现p55-v3主要位于第4染色体而p55-v0主要位于第2染色体。然而P55-V3是否和P55-V0一样能对宿主产生保护性免疫反应及其作用机制如何,目前尚不是很清楚。

pVAX1是目前唯一符合FDA标准的哺乳动物细胞表达载体。它是一种分子量为3.0kb的真核表达载体。其Kan选择抗性和多克隆酶切位点能够克隆大片段目的基因。启动子CMV和BGH polyA信号可以在哺乳动物细胞中高表达重组蛋白。迄今为止,关于pVAX1的研究已经广泛涉及到临床各个方面[6-8]。本研究克隆了p55-v3和p55-v0基因,并构建pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0真核表达载体,转染COS-7细胞,RT-PCR在mRNA水平检测其表达。结果发现pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0转染组能扩增出相应的基因片段,而空载体组不能,表明p55-v3和p55-v0基因片段在真核细胞内RNA水平有转录。这为进一步研究p55-v3的免疫功能,比较p55-v3和p55-v0的免疫作用机制以及PC DNA疫苗的研究提供了基础。

致谢:本研究得到美国NIH马良博士的指导,特此感谢!

1 Theus S A,Sullivan D W,Walzer P Det al.Cellular responses to a 55-kilodalton recombinant Pneumocystis carinii antigen[J].Infect Immun, 1994;62(8):3479-3484.

2 Smulian A G,Sullivan D W,Theus S A.Immunization with recombinant Pneumocystis carinii p55 antigen provides partial protection against infection:characterization of epitope recognition associated with immunization [J].Microbes Infect,2000;2(2):127-136.

3 Ma L,Kutty G,Jia Qet al.Characterizationof variantsof the gene encoding the p55 antigen in Pneumocystis from rats and mice[J].J Med Microbiol,2003;52(Pt 11):955-960.

4 Smulian A G,Theus SA,Denko Net al.A 55 kDa antigenof Pneumocystis carinii:analysis of the cellular immune response and characterization of the gene[J].Mol Microbiol,1993;7(5):745-753.

5 张 帆,卢思奇,王凤云 et al.卡氏肺孢子虫低死亡率sd大鼠动物模型的建立[J].中国寄生虫病防治杂志,2005;18(2):99-102, F002.

6 Feng C Y,Li Q T,Zhang X Yet al.Immune strategies using single-component LipL32 and multi-component recombinant LipL32-41-OmpL1 vaccines against leptospira[J].Braz J Med Biol Res,2009;42(9):796-803. 7 Wang X,Xu W,K ong Xet al.Modulation of lung inflammation by vessel dilator in a mouse model of allergic asthma[J].Respir Res,2009;10(1): 66-73.

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[收稿2009-10-19 修回2009-11-19]

(编辑 倪 鹏)

Construction and identification of pneumocytis cariniieukaryotic expression plasmids of pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0 antigenic gene

FENG Yan-Mei,LUO Yong-Ai,JIANG Tao,HAN Xiao-Li,PENGLi,WU Yu-Rong.Department of Respiratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China

Objective:T o construct eukaryotic expression plasmids ofpneumocystis cariniip55-v3 and p55-v0 antigenic genes and to identify their expression in COS-7 cells at mRNA level.Methods:Pneumocystis cariniitotal RNA was used as the template to amplify p55-v3 and p55-v0 antigenic gene by RT-PCR.The products were connected to pTA2 vector and then cloned in pVAX1 eukaryotic expression vector to construct recombinant plasmids as pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0.After propagated inE.coliDH5α,the recombinant plasmids were transfected into COS-7 cells.After 24 h incubation,the RT-PCR was performed to identify the mRNA expression of p55-v3 and p55-v0 antigenic gene.Results:The recombinant plasmids were qualified by restrictive endonuclease digestion and sequencing.And when compared with that in GenBank,the homologyof p55-v3 antigenic gene was 99.9%in nucleotides and 100%in amino acid.The homology between p55-v0 antigenic gene and the one reported previously in nucleotide and amino acid seguence were 99.8%and 100%.The results of RT-PCR confirmed that p55-v3 and p55-v0 antigenic geneswere transfected into COS-7 cells successfully and the geneswere expressed in the cells.Conclusion:In this study,the recombinant plasmidsof pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0 are conducted successfully and expressed in the COS-7 cells,which provide a basis for clarification of immunologic function of p55-v3 and study of DNA vaccine.

Pneumocystis carinii;p55-v3 and p55-v0;Eukaryotic cell expression

R379.9 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2010)03-0214-04

冯燕梅(1982年-),女,在读博士,主要从事卡氏肺孢子菌肺炎免疫治疗方面的研究,E-mail:gg-mm@126.com;

及指导教师:罗永艾(1942年-),男,教授,博士生导师,主要从事免疫治疗方面的研究;E-mail:luoyongai1942@163.com。