丝状真菌蛋白质组学研究①

张 宇 贺 丹 王 丽 (吉林大学白求恩医学院病原生物学系,长春130021)

真菌是自然界中广泛存在的一类重要微生物,与人类的生产、生活密切相关。丝状真菌作为其中的类群,在食品、药品、酶剂、有机酸的生产和农业的生物防治等方面发挥着极大的作用。但另一方面,其中某些种属也是人和动、植物的重要致病菌[1,2]。为了有效地开发利用真菌资源,防治真菌病害、控制真菌感染,研发新型抗真菌药物和真菌疫苗,有关丝状真菌代谢途径、致病机制等的研究尤为重要。

丝状真菌是多细胞真核生物,其生长、代谢等活动是复杂的过程,在复杂的系统中完成。在各系统中,有一些功能单元,它们协同作用并互相整合,其最终执行者就是蛋白质。以往的研究只是针对某种或几种“关键”蛋白质,难以从整体上系统地阐释生命活动的机制。随着后基因组时代的到来,蛋白质组学(Proteomics)技术的应用对丝状真菌的生命活动、致病机制、代谢途径等研究起到了极大的推进作用。

双向凝胶电泳可以同时分离上千种蛋白质,并且与后续的质谱(如：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matri assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS))和大规模数据处理及图像分析软件相衔接,形成了蛋白质组学的核心技术。但是存在着检测灵敏度低、染色方法与质谱难以整合、低丰度蛋白质无法鉴定等问题。近年来,同位素标记和荧光标记技术的应用、串联质谱分析测定技术的开展、肽序列标签(Peptide sequence tag,PST)技术的应用很大程度上促进了蛋白质组学的发展。

本文主要从丝状真菌的胞内蛋白质组学、亚蛋白质组学和分泌蛋白质组学三个方面进行阐述。

1 胞内蛋白质组学(Intracellular proteomics)

在丝状真菌,最初是针对胞内蛋白质进行研究。2002年,Herna′ndez-Macedo等[3]率先开展了胞内蛋白质组研究。他们应用双向凝胶电泳技术,比较了木质素降解菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在铁存在和缺失状态下,胞内蛋白质的差异表达,发现了21种与铁吸收相关的蛋白质。2004年,Grinyer等[4]首次将质谱测定法用于丝状真菌蛋白质的鉴定。他们在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)蛋白质的双向凝胶电泳图谱中选择96个蛋白质点,利用质谱技术得到肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprinting,PMF),通过检索数据库鉴定出其中25个,如热休克蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶等。这些开创性的工作极大地推动了丝状真菌蛋白质组学的研究。

随着科学技术的不断发展,蛋白质组学技术体系也不断成熟和发展,并用于丝状真菌的代谢途径、致病机制等方面的研究。

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是非常重要的条件致病菌,相关研究成为热点。利用蛋白质组学方法,可以获得环境变化和外界压力条件下菌株的蛋白质表达变化,如对氧化应激的反应等[5]。这其中的许多蛋白质与致病性或毒力因子的调节相关,如热休克蛋白、硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶以及超氧化物歧化酶等,他们在菌株处于氧化应激状态时的表达量增高,使菌体避免宿主免疫细胞的损伤作用,参与菌株的致病过程。蛋白质组学方法也可以发现新的抗原,为烟曲霉感染疾病的诊断提供候选标志物。此外,蛋白质组学方法也可用于研究菌株代谢途径的调节。Kniemeyer等[6]比较了不同碳源存在时,烟曲霉的胞内蛋白质表达情况,阐述了其碳代谢的抑制因素。Carberry和Martin等[5,7]鉴定出的蛋白质如丙氨酸转氨酶、乌头酸水合酶、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚单位等,这些蛋白质都是菌株糖类、脂类、蛋白质代谢过程中的关键酶,功能涉及细胞代谢、蛋白质的合成与转运等。这些数据不仅完善了烟曲霉蛋白质数据库,还将为深入探讨烟曲霉的致病机制以及生长代谢的过程提供资料。其他条件致病菌的相关研究也不断深入。K im等[8]将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和产乳酸菌共培养,发现菌株形态相关蛋白质的表达水平发生了变化。Leng等[9]研究了红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)分生孢子的蛋白质组,发现许多特异蛋白质与孢子的生长和播散相关,可以更好地研究分生孢子萌发和维持休眠状态的分子机制,为阐明菌株的致病机制奠定基础。

蛋白质组学方法为一些植物致病菌感染过程的研究提供了重要信息。Fernández-Acero等[10]建立了灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的蛋白质数据库,功能主要涉及蛋白质代谢、形态变化和氧化还原活性等,如草酸、漆酶、过氧化氢酶等。这些蛋白质在菌体侵染植物时,释放出能够清除活性氧的代谢产物,保护菌体不受损伤,为植物病害的判断和杀菌剂的开发提供了良好的来源。另一种植物致病菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的蛋白质组图谱的绘制也已完成[11],推测其中的α-L-阿拉伯呋喃糖酶与致病性相关。Noir等[12]研究经水仙花碱作用后布氏白粉菌(Blumeria graminisf)的分生孢子蛋白质组图谱。鉴定出180种蛋白质,功能涉及糖类、脂类和蛋白质的分解代谢,说明此时孢子已为增殖、萌发储备能量,参与侵染植物的过程。Lakshman等[13]分离了立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)胞内全部蛋白质,鉴定出11种与生物防治功能相关的蛋白质,探讨了其生物功能以及宿主与病原菌间的相互作用。

虽然已在整体水平上逐渐勾画出丝状真菌的代谢和致病过程相关的蛋白质组图谱,但仍存在着一些问题,如位于细胞器上许多重要的调节分子(如信号转导蛋白、细胞调节因子及转录因子)和疏水性、碱性蛋白质很难被检测到。因此,目前,丝状真菌蛋白质组研究的热点逐渐转向亚细胞(如细胞壁、质膜、细胞器、细胞质和细胞核)的蛋白质。

2 亚蛋白质组学(Subproteomics)

亚蛋白质组学研究的是亚细胞(如细胞壁、质膜、细胞器等)的全部蛋白质[14]。细胞壁是微生物与外界环境相互作用的直接界面。它的结构复杂,锚定和排列着许多蛋白质,在形态发生、粘附、致病性、抗原性方面发挥着重要作用。其中许多已经成为抗真菌药物研发的潜在靶标。但由于其低丰度、低溶解性、疏水性、广泛的糖基化以及共价结合于细胞壁的多糖骨架上等原因,许多细胞壁蛋白质难以分析。Pitarch等人[15]建立了丝状真菌细胞壁蛋白质提取方法,并进行蛋白质组分析。不仅得到了蛋白质组图谱,而且提出了蛋白质间以及蛋白质与细胞壁结构间的相互作用机制。张成省等[16]以链格孢霉(Alternaria alternata)为研究对象,比较了冷碱、热碱和SDS法提取菌丝细胞壁可溶性蛋白质的方法,为探讨病原菌与宿主间的相互识别机制奠定了基础。Asif等[17]为了研究烟曲霉潜在的药物靶点,绘制了该菌的质膜表面蛋白质组图谱。利用细胞壁和质膜的亚蛋白质组学,可以系统地研究菌株的蛋白质分泌和发现新的药物靶点等。

线粒体的相关研究也成为热点。Grinyer等[18]首次建立了成熟的样品制备方法,得到哈茨木霉线粒体蛋白质组图谱,鉴定出25种线粒体特有蛋白质,其功能涉及三羧酸循环、分子伴侣、受体结合与运输以及结构蛋白等方面。Schmitt等[19]分析了粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的线粒体质膜蛋白质组,鉴定出30种蛋白质,其功能涉及物质运输和线粒体形态变化等。

Grinyer等[20]也首次分离和鉴定出里氏木霉(Trichoderma reesei)20S蛋白酶体的13个亚基,绘制了丝状真菌蛋白酶体的蛋白质组图谱。

这种方法的优点是：以细胞器蛋白质作为研究对象,与胞内总蛋白质相比,降低了样品的复杂性,而且细胞的功能单位如细胞器、大分子结构或多蛋白复合体也不会遭到破坏,可以获得低丰度的调节分子和疏水性、碱性蛋白质,亦可以在特定细胞器的特定生理状态下深入了解蛋白质的功能。

3 分泌蛋白质组学(Secretome)

分泌蛋白质组学研究的是丝状真菌分泌蛋白质和与分泌过程相关蛋白质[21]。丝状真菌是腐生菌,需要分泌大量的胞外酶来降解多种物质,以摄取养分、改善生存环境等。对这些分泌蛋白质的研究不但有助于了解其代谢途径和致病机制[7,11],而且在重组蛋白的生产中也有着重要意义[22]。Medina等[23]初步建立了真菌分泌蛋白质组样品制备方法,鉴定出芦丁诱导下黄曲霉(Aspergillus flavus)分泌参与降解的蛋白质。Oda等[24]发现了在液体和固体培养状态下米曲霉(Aspergilllus oryzae)分泌蛋白质的差异表达。Suárez等[25]比较了以几丁质或其他真菌(丝核菌(Rhizoctonia solani)和灰葡萄孢霉等)细胞壁为唯一碳源时,哈茨木霉的分泌蛋白质表达存在显著差异,表达量最高的均是一种新型的天冬氨酸蛋白酶(P6281),提示这种蛋白质在其腐生生活中起主要作用。Paper等[26]鉴定了禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的分泌蛋白质。结果发现体外培养时91%～100%的分泌蛋白质具有信号肽;感染小麦时,只有56%的分泌蛋白质具有信号肽,提示这些蛋白质在禾谷镰刀菌与其宿主植物的相互作用中发挥着重要作用。

分泌蛋白质的分泌量少,低丰度蛋白质获取困难,因此开展全部分泌蛋白的研究较少。但研究分泌蛋白质的优点是：菌株的生长环境便于控制,蛋白质获取过程直接,其他来源(如细胞内、质膜等)蛋白质的干扰较少等。随着蛋白质组学技术的发展,低丰度蛋白质的富集成为可能,丝状真菌的分泌蛋白质组学研究必将迅速开展。

综上,近年来由于高通量、高灵敏度和规模化的双向凝胶电泳-质谱等技术的飞速发展,丝状真菌蛋白质的研究已经取得了较大的成果。虽然作为“新生”领域,仍存在着一些不足,但随着先进技术方法的不断产生和完善、基因组学与生物信息学技术的发展以及政府投资与商业投入的不断增加,丝状真菌蛋白质组学研究必将在21世纪取得突破性的进展。

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