基因治疗脊髓损伤中Ad（腺病毒）-NGF（神经生长因子）的应用研究

杜君好，刘 磊，王贵怀

（1.河南省商丘市第一人民医院神经外科二病区，河南商丘 477100；2.北京垂杨柳医院脑外科，北京 100022；3.首都医科大学附属北京天坛医院神经外科三病区，北京 100050）

基因治疗脊髓损伤中Ad（腺病毒）-NGF（神经生长因子）的应用研究

杜君好1，刘 磊2，王贵怀3

（1.河南省商丘市第一人民医院神经外科二病区，河南商丘 477100；2.北京垂杨柳医院脑外科，北京 100022；3.首都医科大学附属北京天坛医院神经外科三病区，北京 100050）

目的：应用Ad-NGF转染成纤维细胞治疗脊髓半切模型大鼠探讨在基因治疗脊髓损伤中腺病毒作为载体介导的NGF对脊髓损伤的治疗价值。方法：主要材料为Ad-NGF，293细胞，成纤维细胞，大鼠等。成纤维细胞与Ad－NGF悬液混合培养，将细胞注射至脊髓半横切损伤模型大鼠局部。结果：NGF因子在体外实验组可检测到。Ad-NGF转染组单位面积上神经轴突数量比对照组多。结论：NGF因子在体外实验组得到表达，体内修饰组有NGF表达。证实Ad－NGF转染成纤维细胞通过促进脊髓损伤大鼠神经轴突的生长促进损伤神经功能的恢复。

腺病毒-神经生长因子；成纤维细胞；转染；脊髓损伤

我国脊髓损伤发病呈明显上升趋势，给社会带来的问题非常严重，脊髓损伤的治疗一直是未能解决的难题[1-2]。在疾病的基因治疗中经常用腺病毒[3-5]作为靶基因的载体，而神经生长因子[6]（NGF）是最早被发现的一种神经营养因子，用组织细胞培养手段已经证实NGF对神经元具有营养作用[7-8]，本实验将二者结合，对脊髓损伤的Ad-NGF基因治疗进行一次有益的尝试，希望能为脊髓损伤患者找到一种有效的方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及器材

Ad-NGF悬液由北京大学医学部生理与病生理学系提供；HDFa购自Cascade Biologics公司；4℃低温冷冻冰箱（Sanyo公司）；数码照相机（COOLPIX4500，Nikon）；微量振荡器（WZZA，北京海淀电子医疗仪器厂）；电热恒温培养箱（HH.B11.420，上海医疗器械七厂）；10 μl微量注射器（上海仪器厂）。

1.2 实验步骤

1.2.1 人成纤维细胞的培养 HDFa从-80℃冰箱取出后，迅速加温至37℃；1 000 r/s离心，弃上清，吸管吸取含20%胎牛血清的IMDM培养液2 ml吹打混悬；平均分配到3个培养皿中，常规扩增至35个75 cm2培养瓶分别标记为1～35号。

1.2.2 病毒转染使用 细胞达90%密度后，1～16号培养瓶加入Ad-NGF悬液37℃温箱混合培养8 h。

1.2.3 转染细胞的移植 12～16号瓶取上清冰冻保存，标记为1～12号瓶的细胞（4×106个/瓶）消化离心后，用1 ml注射器分别注射至12个脊髓半横切损伤模型大鼠局部；标记为14～16号瓶的细胞消化离心后注射至3只健康大鼠大脑内；17～29号瓶取4瓶上清冰冻保存，细胞消化离心后直接注射至12个脊髓半横切损伤模型大鼠局部；30及31号瓶细胞消化离心后注射至健康大鼠的大脑内。余细胞取上清后，细胞收取冻存。见图1、2。

图1成纤维细胞

图2加入Ad-NGF的成纤维细胞

1.3 统计学方法

使用SPSS 14.0软件用四格表确切概率法对所得数据进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA法检测β-NGF的表达

1∶1 000 稀释包被缓冲液，96 孔板每孔加入 100 μl，4℃过夜；TBST 200 μl/孔，洗板 1次后，加入 1倍 Block and Sample Buffer，200 μl/孔，室温置 1 h；TBST 200 μl/孔，洗板 1 次；标准样品用1倍Block and Sample Buffer稀释1～8倍后分别加入A列1～8孔，用以绘出标准曲线；取脑内注射大鼠的大脑研磨离心取上清；取13～16号瓶及31号瓶取上清，分别稀释1～6倍分别加样至96孔板BCDEFG列孔中；室温下摇床孵育 6 h，TBST 200 μl/孔，洗板 5 次；取 25 μl Anti－NGF mAb 与10 ml 1 倍 Block and Sample Buffer的混合液，每孔加入100 μl，4℃过夜；TBST 200 μl/孔，洗板5次；加入100倍稀释后的Anti-Rat lgG，HRP Conjugate100 μl/孔，室温下摇床孵育 2.5 h；TBST 200 μl/孔，洗板 5 次，室温下加入 TMB100 μl/孔，摇晃孵育10 min；加入1N盐酸100 μl/孔，终止反应；25 min在450 nm读板测定吸光值。读板结果（450 nm吸光值）见图3。

图3各组细胞上清NGF浓度直方图

2.2 组织形态学观察

术后第2、4周，分别心脏灌注各组大鼠，取脊髓标本，进行石蜡包埋制作切片，HE染色、免疫组化染色观察脊髓损伤及修复情况。可见术后第4周，体内修饰组脊髓损伤处胶质瘢痕较小，空洞不明显，可见较多的新生轴突，而空白对照组和体内修饰组则可见较大空洞和瘢痕组织，未见明显新生轴突（图4～6）。

图4 体内未修饰组神经轴突生长较少

2.3 统计学处理

对两组共24个样本平均单位面积上的神经轴突数目做统计，按神经轴突密度将体内修饰组数据与空白对照组比较，密度大者为阳性，密度小者为阴性，得到4个数据，取P=0.05，使用SPSS 14.0软件用四格表确切概率法对4个数据进行统计学计算得P=0.04＜0.05，两组差异有统计学意义，可以认为两组神经轴突数目差别有统计学意义。

3 讨论

图5 体内修饰组神经轴突相对较多

图6空白对照组神经轴突数目相对较少

NGF经腺病毒介导进入成纤维细胞内，在体外培养的细胞上清中使用ELISA染色法可以检测出NGF的表达，而体内实验组使用ELISA染色法都没有检测出NGF的表达，这并不能说明在体内环境中修饰的细胞没有表达NGF，这可能是因为脑脊液的循环使NGF的浓度大大稀释，再者体内多种蛋白酶均可以导致NGF表达后迅速被代谢或者被灭活，导致NGF被表达而难以检测；NGF被表达还有一个间接证明就是单纯的成纤维细胞局部移植后免疫组化染色可见修饰组神经轴突生长较空白对照组数量多，这种情况只能说明是NGF的表达导致了整个结果，这间接证明NGF在体内修饰组是有表达的，因为某种原因使用ELISA法难以检测到它的表达。

NGF可促进脊髓损伤后神经轴突的生长，这可能说明NGF促进神经轴突的生长来促进脊髓损伤大鼠的神经功能恢复。本实验可从以下方面考虑加以改进：①按照病毒滴度分组；②按照成纤维细胞浓度分组；③按照成纤维细胞数量分组；④按照局部移植方法分组；⑤按照转染的时间分组；⑥实验动物使用类人猿或大猩猩等更进一步提高实验的针对性。⑦需要加大实验动物量，进一步证实得到的结果。

[1]王忠诚.神经外科学·脊柱和脊髓疾病篇[M].武汉:湖北科学技术出版社,2005:951-958.

[2]孙天胜,王献章,胥少汀.脊髓损伤修复的现状与展望[J].国外医学:骨科学分册,2003,24(2):67-68.

[3]Lawrence WC,Ginsberg H.Intracellular uncontion of type 5 adnovirus deoxyribonucleic acid[J].Virol,1967,1(1):851-867.

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[6]张淋坤,张引成.神经生长因子和神经节苷脂的研究进展[J].中国实用神经疾病杂志,2010,13(10):89-92.

[7]付小兵.神经生长因子与创伤修复[M].北京:人民军医出版社,1991:161.

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Implication of Ad-NGF in spinal injury′s gene therapy

DU Junhao1,LIU Lei2,WANG Guihuai3
(1.Department of Neurosurgery,Ward 2,the First People′s Hospital of Shangqiu City,Henan Province,Shangqiu 476100,China;2.Department of Cerebral Surgery,Beijing Chuiyangliu Hospital,Beijing 100022,China;3.Department of Neurosurgery,Ward 3,Capital Medical University Affiliated Tiantan Hospital,Beijing 100050,China)

Objective:To investigate effects of adenovirus huNGF gene transferd on spinal cord injury in rats.Methods:Main reagent,Ad-NGF,293 cell,fibroblast,rat,etc.Cultivate Ad-NGF with fibroblast,then inject transferred fibroblast into region of spinal cord injury in rats..ResultsGot brain tissue from transfected rat,grind,centrifugalization,then got supernatant,after treated by ELISA method,determin extinction value.We found cylindraxile numbers in Ad-NGF transfected group was bigger than other groups.Conclusion:NGF can express in extraorgan group,and in vivo infected group.Ad-NGF transfected fibroblast can promote injured nerve function′s recovery through promoting cylindraxile′s grouth.

Ad-NGF;Fibroblast;Transfect;Spinal cord injury;Gene therapy

R-332

A

1674-4721（2010）12（a）-012－02

2010-09-07）