正交试验优选乙肝宁颗粒的澄清工艺Δ

颜红，夏新华，谢安，严建业，徐学云，朱丽，欧金秀，王艳平，熊飞燕（.湖南中医药大学药学院，长沙市 4008；.湖南九芝堂股份有限公司，长沙市 40008）

·中药工艺与制剂·

正交试验优选乙肝宁颗粒的澄清工艺Δ

颜红1＊，夏新华1#，谢安2，严建业1，徐学云2，朱丽2，欧金秀2，王艳平1，熊飞燕1（1.湖南中医药大学药学院，长沙市 410208；2.湖南九芝堂股份有限公司，长沙市 410008）

目的：优选ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清剂用于乙肝宁颗粒的纯化工艺。方法：采用正交试验法对影响絮凝效果的主要因素进行优选，并与醇沉工艺进行比较。结果：采用ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺的芍药苷保留率高，且可改善干膏粉的吸湿性。其最佳澄清条件为药液浓度1∶7，搅拌速度350 r·min-1，80℃加入B组分0.4 mL·g-1，60℃再加入A组分0.2 mL·g-1。结论：ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺可用于乙肝宁颗粒的纯化。

乙肝宁颗粒；ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂；ZTC1+1-Ⅲ型澄清剂；醇沉工艺；正交试验

乙肝宁颗粒是由黄芪、白芍、茵陈、党参、制何首乌、丹参、茯苓等13味中药组成的复方，具有调气健脾、清热利胆、活血化瘀之功效。临床上主要用于治疗慢性迁延性及慢性活动性肝炎等症。该制剂原生产工艺采用醇沉法除杂，但此工艺需要耗费大量的乙醇，成本较高，易造成有效成分的流失，且制得的干浸膏粉吸湿性较强。本试验采用ZTC1+1天然澄清技术对乙肝宁颗粒的纯化工艺进行研究，并以固形物保留率、芍药苷保留率、干浸膏粉的吸湿性为评价指标，与醇沉法进行比较，为乙肝宁颗粒纯化工艺的改进提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪、Waters 2487型紫外检测器、Breez工作站（美国Waters公司）；UV-265型分光光度仪（日本岛津公司）；800型离心沉淀器（长沙市科伟仪器厂）；DF101-S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）。

1.2 试药

芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110736-200320）；ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ天然澄清剂（天津汉威斯特科技开发有限公司）；乙肝宁水提浓缩液（湖南九芝堂股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 澄清剂的制备

2.1.1 ZTC1+1-Ⅱ澄清剂的制备取ZTC1+1-Ⅱ澄清剂A组分适量，先用少量蒸馏水搅成糊状，然后加入需要量的蒸馏水，溶胀24 h，搅匀，即得1%A组分黏胶液。取澄清剂B组分适量，用少量1%醋酸溶解并搅成糊状，加入足够量的1%醋酸，溶胀24 h，搅匀，即得1%B组分黏胶液。

2.1.2 ZTC1+1-Ⅲ澄清剂的制备取ZTC1+1-Ⅲ澄清剂A、B组分，同“2.1.1”项下方法制备。

2.2 样品溶液的测定

2.2.1 固形物保留率的测定分别取纯化前、后的样品溶液25 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，称重，计算固形物保留率（固形物保留率＝纯化后的固形物质量/纯化前的固形物质量×100%）。

2.2.2 吸光度的测定取样品溶液适量，以蒸馏水为空白，于720 nm波长处测定吸光度，即得。

2.2.3 芍药苷含量的测定（1）色谱条件：色谱柱为Prodigy C18（250 mm×4.6 mm，5µm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），检测波长为230 nm，流速为1 mL·min-1，柱温为室温。理论塔板数按芍药苷峰计算应＞3 000。（2）对照品溶液的制备与标准曲线的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积积分值。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，芍药苷进样量（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝7.61×102X－9.88×103（r＝0.999 9）。结果表明，芍药苷进样量在0.20～1.00 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。（3）供试品溶液的制备与测定：精密量取样品溶液适量，用0.45 μm微孔薄膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3 ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清剂用于乙肝宁颗粒的澄清条件的优选[1～3]

2.3.1 澄清剂A、B二组分加入顺序的确定经预试验确定ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清剂的A、B二组分加入顺序均为先加入B组分，后加入A组分。

2.3.2 澄清剂对水提液的纯化处理取一定浓度的乙肝宁水提浓缩液100 mL，置于250 mL烧杯中，于磁力搅拌器上加热恒温至一定温度，在一定搅拌速度下先加入一定量的B组分，每隔30 min搅拌1次，2 h后在一定温度和搅拌速度下加入一定量A组分，再升高至一定温度，保温10～15 min，最后静置30 min再搅拌1次。静置6 h后取出，离心抽滤，得滤液。

2.3.3 单因素考察澄清剂加入量等因素对絮凝效果的影响

按“2.3.2”项下方法操作，通过单因素对比试验考察澄清剂加入量、药液浓度、温度和搅拌对絮凝效果的影响。结果表明，ZTC1+1-Ⅱ澄清剂用于乙肝宁颗粒水提液澄清时，每1 g生药量药液中B组分加入量为0.4 mL，A组分加入量为0.2 mL时，沉淀为颗粒状，滤液吸光度低；药液浓度对絮凝工艺的影响显著，当药液浓度为1∶7时，沉淀完全，滤液吸光度低；A、B组分的加入温度分别以80、60℃为宜；搅拌速度为350 r·min-1时，滤液吸光度低。ZTC1+1-Ⅲ澄清剂用于乙肝宁颗粒水提液澄清时，每1 g生药量药液中B组分加入量为0.6 mL，A组分加入量为0.3 mL时，沉淀为颗粒状，滤液吸光度低；药液浓度为1∶9时，滤液吸光度低，但考虑到1∶9时浓度太小，不适合生产应用，故药液浓度可选择1∶ 5；絮凝温度为60、40℃，70、50℃时，滤液吸光度差别不大，故A、B组分的加入温度以60、40℃为宜；搅拌速度为200 r·min-1时，滤液吸光度低。

2.3.4 正交试验优选ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清剂絮凝澄清的最佳工艺在以上单因素试验的基础上，选择药液浓度（A）、搅拌速度（B）、澄清剂加入量（C）3个对絮凝澄清效果影响较大的因素作为正交试验的考察因素，并以吸光度、固形物保留率及芍药苷的含量作为评价指标，按L9（34）正交表安排试验。ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺因素水平见表 1；正交试验结果见表 2；方差分析结果见表3、表4、表5。

表1 ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺因素水平Tab 1 Factors and levels of ZTC1+1-Ⅱclarification technology

表2 ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺正交试验结果Tab 2 Results of ZTC1+1-Ⅱclarification technology in orthogonal experiment

由表1～表5可知，影响澄清效果的因素大小依次为A＞B＞C；方差分析表明A、C对澄清效果均有显著性影响，而B因素的影响则不显著。结合前面单因素对比试验结果，确定ZTC1+1-Ⅱ最佳澄清工艺条件为A2B2C2，即取浓度为1∶7的药液，在80℃及350 r·min-1的搅拌条件下加入B组分0.4 mL· g-1，然后每隔30 min搅拌1次，2 h后在60℃及350 r·min-1的搅拌条件下加入A组分0.2 mL·g-1，搅拌10 min，升高温度至80℃，保温10 min，最后静置30 min再搅拌1次，静置6 h后离心抽滤，即得。

表3 ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺吸光度方差分析结果Tab 3 Absorbance variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

表4 ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺固形物保留率方差分析结果Tab 4 Solid retention variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

ZTC1+1-Ⅲ澄清工艺因素水平见表 6；正交试验结果见表 7；方差分析结果见表8、表9、表10。

由表6～表10可知，影响澄清效果的因素大小依次为A＞B＞C；方差分析表明A因素对澄清效果有显著性影响，而B、C因素的影响则不显著。结合前面单因素对比试验结果，确定ZTC1+1-Ⅲ最佳澄清工艺条件为A2B3C2或A2B2C2，即取浓度为1∶5的药液，在60℃及200～250 r·min-1的搅拌条件下加入B组分0.6 mL·g-1，然后每隔30 min搅拌1次，2 h后在40℃及200～250 r·min-1的搅拌条件下加入A组分0.3 mL·g-1，搅拌20 min，升高温度至80℃，保温15 min，最后静置30 min再搅拌1次，静置6 h后离心抽滤，即得。

表5 ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺芍药苷含量方差分析结果Tab 5 Paeoniflorin content variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

表6 ZTC1+1-Ⅲ澄清工艺因素水平Tab 6 Factors and levels of ZTC1+1-Ⅲclarification technology

2.4 ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ絮凝澄清工艺与醇沉工艺的比较

表7 ZTC1+1-Ⅲ澄清工艺正交试验结果Tab 7 Results of ZTC1+1-Ⅲclarification technology in orthogonal experiment

表8 ZTC1+1-Ⅲ澄清工艺吸光度方差分析结果Tab 8 Absorbance variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

表9 ZTC1+1-Ⅲ澄清工艺固形物保留率方差分析结果Tab 9Solid retention variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

表10 ZTC1+1-Ⅲ澄清工艺芍药苷含量方差分析结果Tab 10 Paeoniflorin content variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

2.4.1 醇沉处理液与ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清剂处理液的制备取浓度为3∶1的乙肝宁浓缩液100 mL，加乙醇使含醇量达55%，搅匀，静置24 h，滤过，得醇沉处理液。取浓度为1∶7的乙肝宁药液280 mL（含生药量40 g），加入B组分16 mL、A组分8 mL，按上述优选的工艺条件制备，滤过，得ZTC1+1-Ⅱ澄清剂的处理液。取浓度为1∶5的乙肝宁药液200 mL（含生药量40 g），加入B组分24 mL、A组分12 mL，按上述优选的工艺条件制备，滤过，得ZTC1+1-Ⅲ澄清剂的处理液。

2.4.2 固形物保留率、芍药苷保留率的比较取以上3种纯化工艺的处理液，按“2.2”项下方法进行测定。3种纯化工艺的固形物保留率与芍药苷保留率比较结果见表11。

2.4.3 干膏粉吸湿性的比较取上述3种纯化工艺处理后的干浸膏粉适量，置五氧化二磷干燥器内干燥48 h至恒重。将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入25℃的恒温培养箱内恒温24 h，此时干燥器内的相对湿度为75%。在已恒重的称量瓶底部放入厚约2 mm的干膏粉，准确称重后置于上述玻璃干燥器内（称量瓶盖打开）于25℃恒温培养箱贮藏，定时（6、12、24、36、48、60、72 h）称量，计算吸湿百分率。3种纯化工艺的干膏粉吸湿曲线见图1。

表113 种纯化工艺的固形物保留率与芍药苷保留率比较结果（n＝3）Tab11Comparisonofretentionrateofsolidsand paeoniflorin among 3 kinds of clarification technology（n＝3）

图13 种纯化工艺的干膏粉吸湿曲线Fig1Hygroscopic curves of powder of 3 kinds of clarification technology

3 讨论

目前，絮凝澄清法替代传统的醇沉法用于中药制剂的纯化工艺已有较多的研究报道。研究表明[4～6]，ZTC1+1絮凝澄清法具有生产安全、周期短、生产成本低、有效成分损失少等优点。

对乙肝宁颗粒澄清工艺的研究表明，ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+ 1-Ⅲ纯化工艺的固形物保留率高于醇沉工艺，对主要有效成分芍药苷的保留率及干浸膏粉的吸湿性方面均优于醇沉工艺，且以ZTC1+1-Ⅱ纯化工艺为佳，表明ZTC1+1-Ⅱ澄清工艺可用于乙肝宁颗粒的纯化。

[1]王亮亮，张黎明.ZTC澄清剂对黄姜总皂苷提取液的澄清工艺研究[J].天津科技大学学报，2006，21（4）：29.

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[6]张三平.吸附澄清剂在中药制剂中的应用研究[J].中国药房，2008，19（6）：461.

Optimization of the Clarification Technology of Yiganning Granules by Orthogonal Experiment

YAN Hong，XIA Xin-hua，YAN Jian-ye，WANG Yan-ping，XIONG Fei-yan（School of Pharmacy，Hunan University of TCM，Changsha 410208，China）
XIE An，XU Xue-yun，ZHU Li，OU Jin-xiu（Hunan Jiuzhitang Co.，Ltd.，Changsha 410008，China）

OBJECTIVE：To optimize the clarification technology of Yiganning granules by ZTC1+1-Ⅱand ZTC1+1-Ⅲclearing agent.METHODS：Orthogonal experiment was applied to optimize the influence factors of flocculation effect and compared with alcohol precipitation technology.RESULTS：Retention rate of peoniflorin in ZTC1+1-Ⅱclarification technology was high and improve the hygroscopicity of powder.The optimal conditions were as follows：extracting solution concentration was 1∶7，the whisking speed was 350 r·min-1；0.4 mL·g-1B was added into solution at 80℃，then 0.2 mL·g-1A was added into solution at 60℃.CONCLUSION：ZTC1+1-Ⅱclarification technology can be used to purify Yiganning granules.

Yiganning granules；ZTC1+1-Ⅱclearing agent；ZTC1+1-Ⅲclearing agent；Alcohol precipitation technology；Orthogonal experiment

R 283；R97

A

1001-0408（2010）15-1364-04

2009-05-12

2009-10-25）

Δ国家科技攻关计划课题（2001BA701A48）

＊讲师。研究方向：中药制剂新技术与新剂型。E-mail：yh-8632@126.com

＃通讯作者：教授，博士研究生导师。研究方向：中药制剂新技术与新剂型。电话：0731-8458305。E-mail：xiaxinhua001@163.com