RP-HPLC法同时测定巴戟天中4种蒽醌类化合物的含量

鲍蕾蕾，吴岩斌，秦路平，卞俊，张巧艳#

（1.第二军医大学药学院生药教研室，上海市 200433；2.解放军第411医院，上海市 200434；3.福建中医学院中西医结合研究院，福州市 350108）

巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的根，是我国传统中药，分布于广东、福建、广西、海南、江西等省区，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用，用于治疗阳痿遗精、宫冷不孕、风湿痹痛等证[1]。现代化学和药理研究表明，巴戟天含有葸醌类、环烯醚萜苷和多糖等化学成分，具有增强免疫、抗抑郁、抗氧化、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗骨质疏松等作用[2]。有文献报道[3]，巴戟天的野生药材、栽培药材及栽培药材不同农家类型的种质资源存在较大的变异，使其活性成分的组成和含量发生了变化，造成其药材品质存在较大差异，从而影响临床用药的安全、有效。鉴于此，笔者采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定巴戟天中4种蒽醌类化合物的含量，以为巴戟天药材的生产和质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1200系列HPLC仪，包括四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器（DAD）、柱温箱、真空脱气机、Chemstation 10.2工作站（美国Agilent公司）；BP211D型十万分之一天平（德国Sartorius公司）。

磷酸（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、2-羟基-1-甲氧基蒽醌和2-羟基-3-羟甲基蒽醌标准品均为第二军医大学药学院生药教研室自制，经HPLC-DAD检测纯度均＞98%；巴戟天药材商品分别于2009年6月购自广东肇庆、德庆、清远三地，经第二军医大学生药学教研室张巧艳副教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：0.2%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱（梯度洗脱时间见表1）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：277 nm。以甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、2-羟基-1-甲氧基蒽醌和2-羟基-3-羟甲基蒽醌计算，理论塔板数均应＞5000；4种标准品的分离度均＞1.5。色谱见图1。

表1 梯度洗脱时间Tab 1 Timetable of gradient elution

2.2 混合标准品溶液的制备

分别精密称取甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、2-羟基-1-甲氧基蒽醌和2-羟基-3-羟甲基蒽醌标准品各5 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取贮备液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加入起始流动相至刻度，摇匀，制备成每1 mL含有20µg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取巴戟天药材，22～25℃自然风干，粉碎后过2号筛，精密称取药材粉末2.0008 g，置250 mL烧瓶中，加入100 mL 95%乙醇，称重，回流提取2次，每次2 h，放置至室温，用95%乙醇补足失重，离心后定容至5 mL，并通过0.45 μm滤膜，滤液置于棕色样品瓶中，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取上述混合标准品溶液，加甲醇稀释成0.1、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0、250.0、500.0 μg·mL-1不同浓度，进样20 μL，记录峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，制备标准曲线，相关数据见表2。

表2 4种蒽醌类化合物的标准曲线Tab 2 Standard curves of 4 kinds of anthraquinones

2.4.2 精密度试验 取同一份混合标准品溶液20 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果，2-羟基-3-羟甲基蒽醌、2-羟基-1-甲氧基蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素峰面积的RSD分别为0.61%、0.60%、0.78%和0.54%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液20 μL，分别于0、3、6、9、12、24 h进样测定。结果，2-羟基-3-羟甲基蒽醌、2-羟基-1-甲氧基蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素峰面积的RSD分别为0.72%、0.90%、1.02%、1.04%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品药材2 g，共6份，精密称定，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，各取20 μL注入液相色谱仪，按外标法测定含量。结果，2-羟基-3-羟甲基蒽醌、2-羟基-1-甲氧基蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素的平均含量分别为94.3557、164.4324、80.2636、21.5345 µg·g-1，RSD分别为1.76%、2.51%、1.09%、1.57%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 称取已知含量的药材粉末约2 g，共6份，分别精密加入4种标准品适量，按“2.3”项下方法提取样品并测定含量，计算加样回收率。结果，2-羟基-3-羟甲基蒽醌、2-羟基-1-甲氧基蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素的平均回收率分别为98.69%、99.67%、97.91%、99.74%，RSD分别为0.90%、1.97%、1.14%、0.41%（n＝6）。

2.5 3批不同产地巴戟天中蒽醌类成分的含量测定结果

称取3批不同产地的巴戟天药材粉末各2 g，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取20µL注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中的4种蒽醌类化合物的含量，结果见表3。

表3 样品中4种蒽醌类化合物的含量测定结果（µg·g-1，n＝3）Tab 3 Content determination of 4 kinds of anthraquinones in samples（µg·g-1，n＝3）

3 讨论

在选择流动相时，主要考察了甲醇-水和乙腈-水两元系统。由于巴戟天蒽醌多数为苷元，呈弱酸性，所以分别考虑在水中添加酸试剂得到0.1%甲酸、0.1%醋酸和0.2%磷酸水溶液进一步进行流动相筛选。结果表明，以乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱的分离效果较好，故选择了乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相。

在进行柱温选择时，考察了柱温为15、20、25、30、35、40 ℃对色谱分离效果的影响。结果表明，柱温对保留时间在20 min以后的色谱峰的分离有明显的影响：柱温从15℃变化至40℃，色谱峰均前移，保留时间缩短，只有在30℃时最为合适，各峰的分离度符合要求。因此，选定柱温为30℃。

在考察提取溶剂时，笔者分别用95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、95%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙酸乙酯、氯仿和丙酮对巴戟天进行超声提取和回流提取，根据“2.1”项下色谱条件对其进行分析。结果发现，乙酸乙酯、氯仿和丙酮对样品的提取适用于HPLC分析，但提取不够完全，得到的峰数少且峰面积较小；75%乙醇、50%乙醇、75%甲醇、50%甲醇提取较完全，但提出蒽醌量较低；95%乙醇和95%甲醇对样品提取较完全且杂质相对较少，且95%乙醇较95%甲醇提取效果稍好；而回流提取效果优于超声提取。在回流提取的条件下，笔者相应考察了提取时间，发现回流提取2次，每次2 h基本可以提取完全。因此，最终确定样品采用95%乙醇回流提取2次，每次2 h。

巴戟天药材由于不同农家种植资源类型及生长环境的影响，其活性成分的组成和含量常存在较大的差异，会直接影响该药材的品质和质量。蒽醌类化合物是巴戟天的主要化学活性成分，故对其建立方便、快速的检测方法来控制巴戟天的质量非常必要。本试验方法简便、准确、重复性好，可用于巴戟天药材中4种蒽醌类化合物的含量测定。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：45.

[2]杨黎辉，闰福曼，陈朝凤.中药巴戟天提取物药理作用研究进展[J].中医药学报，2005，33（2）：6.

[3]丁 平，徐吉银，楚桐丽.巴戟天不同农家类型种质资源的RAPD分析[J].中药材，2006，29（1）：1.