人乳铁蛋白对细胞增殖的影响

仇志琴李志沭黄玉政杨 欢成 勇

(南京医科大学附属无锡市第二人民医院,江苏 无锡 214002)

人乳铁蛋白对细胞增殖的影响

仇志琴1李志沭2黄玉政1杨 欢3成 勇1

(南京医科大学附属无锡市第二人民医院,江苏 无锡 214002)

目的 探讨人乳铁蛋白(hLF)对体外培养细胞生长特性的影响。方法 M TT法评定 hLF对人鼻咽癌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人肝脏细胞的生长抑制作用。结果 乳铁蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE的增殖有抑制作用并呈现剂量依赖性,对正常细胞无抑制作用。结论 hLF可能是一种效果较好的新的抗肿瘤化学剂。

人乳铁蛋白;癌细胞;细胞增殖

人乳铁蛋白(Hum an Lactoferrin,hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白,乳汁中特别是初乳中含量最高,具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用〔1,2〕。国外有学者将其应用于肿瘤患者的治疗〔3〕,但是对其作用机制的研究较少。目前国内较少有关于hLF作用于细胞的报道,我们选用易早期转移的鼻咽癌(NPC)细胞作为研究对象〔4〕,以中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)、人肝脏细胞(L02)作为正常细胞对照,观察 hLF在体外是否具有抑制癌细胞生长的作用,探讨 hLF抗肿瘤的作用机制,从而为肿瘤的治疗提供研究基础,为临床实验及应用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌细胞(CNE)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)均购自中国科学院上海细胞资源中心。重组hLF(Lot:L0520,溶于 PBS中,储存浓度 5mg/m l,-20℃储存备用)和噻唑蓝(M TT,Lot:M 2128)均购自 Sigma公司。RPM I1640、胎牛血清购自 HyC lone公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 各细胞系均应用含 10%胎牛血清和 1%青链霉素的 RPM I1640培养基,5%CO2,37℃培养。

1.2.2 M TT法检测细胞增殖 设空白对照组和 hLF干预组。待细胞生长至对数生长期,接种于 96孔细胞培养板,接种数为5×104/孔。每组细胞设 5个平行孔,各组细胞分别加入不同浓度的 hLF(0,1.25×10-3,2.5×10-3,5×10-3,10×10-3, 20×10-3,40×10-3g/L),每孔均为 200μl。作用 24 h后,加入M TT(5 g/L,每孔 20μl),继续培养 4 h,测定A 570 nm吸光度。1.2.3 细胞形态观察 细胞经 hLF处理后,倾去上层悬浮死细胞并用 PBS洗两遍,加入新鲜培养基。同样处理对照孔细胞,将细胞置于倒置显微镜下,观察细胞形态的变化。

2 结 果

2.1 重组 hLF对鼻咽癌细胞 CNE、人肝脏细胞L02、中国仓鼠细胞CHO系的增殖能力的影响 对CNE呈现剂量依赖性的抑制作用,而对正常细胞无抑制作用,见表 1。

表 1 人乳铁蛋白对各细胞体外增殖的影响(±s)

表 1 人乳铁蛋白对各细胞体外增殖的影响(±s)

与空白对照比较:1)P<0.05

hLF剂量(g/L) CNE细胞系 L02细胞系 CHO细胞系0 2.795±0.05 1.900±0.05 2.312±0.15 1.25×10-32.488±0.10 1.810±0.10 2.229±0.05 2.5×10-32.512±0.21 1.792±0.14 2.230±0.10 5×10-32.001±0.051)1.800±0.03 2.152±0.04 10×10-31.810±0.151)1.716±0.30 2.178±0.10 20×10-31.665±0.041)1.780±0.30 2.155±0.05 40×10-31.300±0.051)1.690±0.15 2.104±0.18

2.2 细胞形态学观察 显微镜镜下可见,空白对照组癌细胞密集成片生长,如铺路卵石状,细胞膜圆润,透明,颗粒较少,细胞间界限清楚,并可隐约见到细胞核。hLF处理组癌细胞形态发生明显的改变,随 hLF浓度增加,细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长,逐渐表现为生长缓慢,黏附力降低,细胞变圆,细胞胞质粗糙,细胞内颗粒逐渐增多,且透明度降低,立体感较差,细胞形态完整性受损,而正常细胞在hLF作用下无显著变化 (见图 1)。

图1 细胞镜检图

3 讨 论

hLF多种生物学功能通过免疫系统的激活与调节得以实现〔5〕。Bezaul〔6〕研究发现,乳铁蛋白能抑制鼠实体瘤的生长和转移。肿瘤内注射LF,可以明显的减小实体瘤的体积,且作用效果与 LF干预天数相关。研究〔7,8〕发现,乳铁蛋白的抗头颈部肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞增殖实现的。W o lf〔3〕等发现,人乳铁蛋白通过阻断头颈部肿瘤细胞由 G0到 G1期的转化来抑制肿瘤细胞的增殖。人乳铁蛋白对鼠的 SCC细胞系生长的抑制作用,与剂量成正相关;而且人乳铁蛋白抑制头颈部细胞癌的作用是通过直接的细胞毒作用及系统性的免疫调节作用实现的。Varadhachary〔9〕等人做了大量的口服临床试验,证实乳铁蛋白无药物相关的有害作用。鼻咽癌作为头颈部肿瘤之一,其恶性程度较高〔4〕,早期即可出现颈部淋巴结转移,临床上有转移至骨盆、肺、肝等多器官的病例〔10〕。选用鼻咽癌细胞作为研究对象,具有一定的代表意义。

本研究结果显示,人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞增殖,且呈剂量依赖性,对正常细胞的增殖无明显抑制作用。这一结果,为开发乳铁蛋白的抗癌功效提供了理论依据。

1 曹劲松 .初乳功能性食品〔M〕.北京:中国轻工业出版社,2000:1-10.

2 黄玉政,成 勇,柏亚军,等 .人乳铁蛋白转基因小鼠杂交选育的研究〔J〕.动物医学进展,2007;28(6):39-43.

3 W olf JS,L i GY,Varadhachary A,et a l.O ral lactoferrin results in T cell dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo〔J〕.C lin Cancer Res,2007;13(5):1601-10.

4 张本华 .临床肿瘤学〔M〕.北京:科学技术文献出版社,2007:30-40.

5 CumberbatchM,Dearman RJ,U ribe-Luna S,et a l.Regulation of ep iderm alLangerhans cellm igration by lactoferrin〔J〕.Immunology,2000;100 (1):21-8.

6 Bezault J,Bhimani R,W ipm vnick J,et a l.Human lactoferrin inhibits grow th of solid tumors and development of experim entalmetastases in m ice〔J〕.CancerRes,1994;54(9):2310-2.

7 X iao Y,M onitto CL,M inhas KM,et a l.Lac toferrin dow n regu lates G1 cyclin-dependen t kinasesduring grow th arrestof head and neck cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res,2004;10(23):8683-6.

8 Dam iens E,Elyazid i I,M azu rier J,eta l.Lactoferrin inhibitsG1 cyclin-dependent kinases du ring grow th arrest of hum an breast carcinom a〔J〕.J CellB iochem,1999;74(3):486-98.

9 Varadhachary A,W o lf JS,Petrak K,et a l.O ral lactoferrin inhibits grow th of estab lished tumo rsand poten tiatesconventionalchemotherapy〔J〕.Int J Cancer,2004;111(3):398-403.

10 苏沛珠,黄 泳 .鼻咽癌转移相关分子标志物的研究进展〔J〕.中国现代医生,2009;47(3):50-2.

〔2009-02-16收稿 2009-10-30修回〕

(编辑 贾春澍/张 慧)

Study on inh ib ition of lactoferr in on prolifera tion of cells in v itro

Q IU Zh i-Q in,L IZh i-Shu,HUANG Y u-Zheng,et a l.

The Second Hosp ita l ofW ux i,A ffilia ted to Nan jingM ed ica l Un iversity,W ux i214002,Jiangsu,Ch ina

O b jective To exp lore the effectof lactoferrin on p ro liferation of the cu ltured cells in vitro.M ethods M TT assaywas used to evaluate the grow th inhibition effectof lactoferrin on CNE,L02 and CHO cell lines.Resu lts Lactoferrin significantly inhibited the p ro liferation of CNE cells in a dose-dependentm anner,but had no effect on the norm al cells.Conc lusion s Lactoferrin as a new cancer chemo-p reventive agent cou ld significantly inhibit the grow th of carcinom a cells.

Hum an lactoferrin;Carcinom a cells;Cellp ro liferation

book=30,ebook=24

R-331

A

1005-9202(2010)04-0504-02

江苏省 135重点实验室开放课题(W K0511);江苏省卫生厅科研项目(X2007036)

1 扬州大学江苏省转基因制药工程研究中心

2 江苏省沭阳人民医院 3 苏州大学附属第二医院

成 勇(1956-),男,教授,博士生导师,主要从事胚胎工程与转基因研究。

黄玉政(1982-),男,硕士,助理研究员,主要从事胚胎工程与转基因研究。

仇志琴(1982-),女,住院医师,主要从事临床妇产医学与生殖医学等工作。