菟丝子黄酮对慢性肝损伤保护作用的研究

宋 敏，于季军，杨丹彤，孟景会

（1.河南大学生命科学学院，河南 开封 475004；2.开封市第二人民医院，河南 开封 475002；3.山东省优生技术重点实验室，山东 济南 250002；4.广东嘉应制药股份有限公司，广东 梅州 514021）

菟丝子为旋花科一年生寄生性蔓草菟丝子（Cuscu ta ch inensis L am.）或大菟丝子（C.j ap on ica Choisy）的成熟种子，具有补阳益阴、固精缩尿、明目止泻的功效[1]。黄酮类物质是菟丝子的主要活性成分，其中以槲皮素和山萘酚为代表[2]，在免疫、心血管方面有显著作用，在抗氧化、抗衰老方面也有一定作用，有试验报道菟丝子还具有促进皮肤细胞分化的功能[3]。菟丝子醇提水溶液皮下注射小白鼠半数致死量为2.465 g/kg，30～40 g/kg灌胃并不出现中毒症状，是一味温而不燥、补而不滞、平补肝肾的良药。但目前菟丝子的保肝功能研究较少，仅见宋敏报道[4]。笔者通过腹腔注射10%四氯化碳/橄榄油建立小鼠慢性肝损伤模型并对模型动物灌服菟丝子黄酮来探讨菟丝子黄酮对小鼠慢性肝损伤的保护作用。以期为利用菟丝子植物资源作为保肝药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 昆明种小白鼠，购自郑州大学医学院动物试验中心，体重18～22 g，雄性。

1.1.2 试剂及药品 菟丝子（Semen cuscutae flavonoids） 购自开封市中医院；ALT、AST、SOD、MDA、GSH检测试剂盒、苏木精、伊红染液（南京建成生物工程研究所）；芦丁（中国药品生物制品鉴定所）；四氯化碳、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、甲醇、橄榄油等药品均为分析纯（河南大学设备科）。

1.1.3 仪器设备 721分光光度计、高速台式离心机、电子分析天平、电热恒温水浴锅、索氏提取器。

1.2 试验方法

1.2.1 药品制备 取菟丝子干燥种子，粉碎。石油醚去脂，用8倍体积95%乙醇90℃提取6 h。回收乙醇，定容。以燥至恒重的芦丁为标准品，500 nm处测定吸收度，作标准曲线。测定提取液中菟丝子黄酮浓度。经测定，菟丝子干燥种子黄酮含量为1%，将样品制成终浓度5.5 mg/mL以备后用。

1.2.2 动物处理 将45只小鼠随机分成3组，每组15只。对照组：自由饮水取食；模型组：腹腔注射10%CCl4/橄榄油10 mL/kg、每周2次、自由饮水取食；药剂组：腹腔注射10%CCl4/橄榄油10 mL/kg、每周2次、自由饮水取食，按10 mL/kg体重灌服5.5 mg/mL菟丝子黄酮。试验期间喂正常颗粒饲料，不限食量。连续4周后停止给药。

1.2.3 样品处理及生化指标的检测 最后一次注射药物后3组动物禁食，正常饮水，16 h后，眼球采血，采血后立即将装有血样的试管放入37℃恒温箱中静置3 h，1 500 r/min分离心15 min，分离血清，血清分装贮存于4℃冰箱中待分析，测定方法按照试剂盒说明书进行。肝脏组织用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光学树脂封片，光镜下观察肝脏组织病理学改变。

2 结果与分析

2.1 各组小鼠生长发育情况

试验过程中，对照组小鼠精神状态好，毛发有光泽，食欲佳，排便正常。菟丝子水煎剂组、菟丝子大剂量黄酮组、菟丝子小量黄酮组及模型组在试验初期外观相似，毛发无光泽，食欲差，体重增长缓慢，多数小鼠出现腹泻。但随着治疗时间的延长，黄酮组小鼠状态逐渐好转。解剖学观察，空白组小鼠肝脏表面无脂肪附着。本试验选取肝体比作为测定指标，即（全肝湿重/体重）×100。正常时各肝脏与体重的比值比较恒定。动物染毒后，受损肝脏重量可以发生改变，故肝体比也随之而改变。肝体比增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；肝体比减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。经t检验分析表明，模型组小鼠的肝体比明显高于对照组（p<0.01），肝脏表面附着脂肪。菟丝子黄酮组小鼠肝体比较模型组降低显著（p<0.01），肝脏表面附着少量脂肪但未见点状坏死。

表1 小鼠的肝体比

2.2 各组小鼠ALT、AST检测结果

各组小鼠AST、ALT检测结果显示：与对照组相比，模型组小鼠AST、ALT水平明显升高，经t检验分析表明两者差异极显著（p<0.01），菟丝子黄酮药剂组能够降低血清AST、ALT水平，效果显著（p<0.01）。

表2 小鼠的ALT及AST的活性

2.3 各组小鼠SOD、MDA、GSH检测结果

各组小鼠SOD、MDA、GSH检测结果显示：与对照组相比，模型组小鼠SOD、GSH水平明显降低，经t检验分析表明两者差异极显著（p<0.01），MDA水平明显升高（p<0.01）。菟丝子黄酮药剂组能够提高SOD、GSH水平，降低MDA水平，效果显著（p<0.01）。

表3 小鼠的SOD、MDA、GSH的活性

2.4 肝脏的病理学检测

对照组小鼠肝脏被膜光滑，呈红褐色，质地均匀。模型组小鼠肝脏被膜不光滑并有少量脂肪附着，肝脏颜色较对照组小鼠暗淡，质地较硬。菟丝子黄酮药剂组肝脏颜色较对照组小鼠暗淡，但颜色明显比模型组深，质地较硬。显微结构显示，空白组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，肝细胞核圆形，胞质红染，肝细胞无变性、坏死、炎症细胞浸润及纤维增生。模型组多数肝小叶正常结构被破坏，肝细胞变性坏死明显，表现为脂肪变性和细胞水肿，胞浆疏松化、核深染，伴有点状、灶状程度不等、范围不一的肝细胞坏死及炎症细胞浸润，汇管区扩大，有粗细不均的纤维束从汇管区伸出，纤维增生。菟丝子黄酮药剂组肝小叶结构模糊，少数肝细胞坏死，肝小叶中央区及部分门管区可见轻度脂肪变性，炎性细胞浸润和肝纤维化程度有不同程度的减轻。这说明菟丝子黄酮药剂组有明显的保肝作用。

3 讨论

CCl4是经典的药物性肝损害造模药物，CCl4进入机体，在肝脏经微粒体细胞色素P-450激活后，产生活泼的三氯甲基自由基（CCl3·），三氯甲基自由基可攻击细胞膜上的磷脂分子，引起脂质过氧化反应，最终导致生物膜破坏，肝细胞坏死[5-6]。由于肝细胞坏死，细胞膜通透性增加，ALT、AST大量渗入血液使血中酶活增高[7]。所以血清中ALT、AST这两种转氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死的程度。

SOD是细胞内天然的氧自由基清除剂，而MDA则是氧自由基与细胞表面不饱和脂肪酸反应（脂质过氧化反应）的产物[8]。SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。小鼠腹腔注射CCl4导致慢性肝损伤，过量的氧自由基产生于肝细胞并对其损伤，会引起SOD水平的降低和MDA水平的升高。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。小鼠腹腔注射CCl4导致慢性肝损伤，细胞膜表面发生脂质过氧化反应，最终导致细胞膜破坏，会引起GSH水平的降低。

本试验结果显示，菟丝子黄酮能够降低血清中ALT、AST、MDA水平，提高血清中SOD、全血中GSH水平，即能够有效地保护肝细胞，使肝细胞损伤程度降低，减少纤维化。其作用机制可能是通过清除氧自由基、抑制脂质过氧化、稳定肝细胞膜而达到的。

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