影响玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生因素的研究

王小红

（南通农业职业技术学院，江苏 南通 226006）

生物技术的迅速发展为加快玉米育种进程开辟了新途径，玉米体细胞培养技术不断取得进展。利用玉米不同器官作外植体进行组织培养的研究显得格外重要。研究建立有效的组织培养系统，从中获得大量再生植株是玉米育种工作的首要前提。自1975年Green首次从玉米未成熟胚培养出愈伤组织，并成功地获得了再生植株以来，玉米幼胚培养技术有了快速发展。虽现在几乎能从玉米各个部位诱导出愈伤组织，但幼胚是最易诱导也是使用最多的外植体。诱导玉米幼胚产生胚性愈伤组织及胚性愈伤组织分化受诸多因素的影响，包括基因型、培养基组成和培养条件、幼胚大小等。笔者选用抗性好、适宜本地种植的玉米自交系幼胚进行了外植体的愈伤组织诱导研究，旨在建立具有胚性的愈伤组织培养体系，为玉米遗传转化提供受体材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 供试材料为玉米自交系515、齐319、鲁原 341、502，海南种植。

1.1.2 试剂与仪器 抗生素、生长素、封口膜等购于上海生工。烘箱、离心机、超净工作台、气候箱等由南通农业职业技术学院生物技术实验室提供。

1.1.3 培养基 （1）MS诱导培养基：MS培养基+0.5 g/L Pro、40 g/L 蔗糖、0～2.5 mg/L 2，4-D 、0.5 mg/L氨基苯甲酸、0.5 mg/L泛酸钙、0.25 mg/L核黄素；（2）MS继代培养基：MS培养基+1.0 mg/L 、0.5 g/L Pro、30 g/L 蔗糖；（3）分化培养基：MS 培养基+30 g/L蔗糖、0～2 mg/L 6-BA ；（4）生根培养基：N 6 培养基+20～30 g/L 冰糖、5 g/L 活性炭、1 mg/L 6-BA 。

1.2 方法

1.2.1 幼胚的预处理 取授粉后11～13 d的玉米果穗，剥去最外两层苞叶。用70%乙醇喷洒苞叶表面，然后剥去层层苞叶，当剩最后一层时，再用70%乙醇喷洒苞叶表面，立刻将果穗转入超净工作台。去掉苞叶和花丝，用解剖刀削去子粒顶部2/3胚乳，用镊子从中上部挑出幼胚（幼胚大小最适0.8～2.0 mm）。盾片朝上放入诱导培养基，避光、27℃下诱导出愈伤组织。

1.2.2 玉米愈伤的继代培养 诱导出的长势好的愈伤组织夹成2～3 mm大小的块，在继代培养基培养，约10～12 d继代一次，进行愈伤组织的增殖。培养温度为28℃，光照10～12 h/d，光照强度800～1 000 Lx，日光灯照明。

1.2.3 愈伤组织再分化及植株的再生 将抗性的愈伤挑入分化培养基中光照培养，再生植株。当再生苗在三角瓶中长到6～9 cm高时，将其移到小的花盆中(下层为灭菌的壤土，上层为蛭石)，每天浇l/10 MS营养液，并套袋保湿，在大棚中培养10 d左右，移栽到土壤中。

1.2.4 影响愈伤组织诱导的各因素 （1）胚龄和基因型对胚性愈伤组织诱导率的影响：分别取授粉后8、9、10、11、12、13 d(海南地区夏播)的玉米幼胚，幼胚长度约在1～3 mm左右，基因型分别为齐319、515、鲁原 341、502，在加有 0.5 m g/L 2，4-D 的诱导培养基上培养，在20 d左右统计胚性愈伤组织的诱导率，并对胚龄和基因型两因素进行随机试验方差分析。（2）2，4-D浓度对胚性愈伤组织诱导的影响：取授粉10 d的齐319、鲁原34的玉米幼胚，在 2，4-D 浓度为：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的诱导培养基上培养，25 d后统计胚性愈伤组织块数。

2 结果与分析

2.1 影响愈伤组织诱导的因素

2.1.1 胚龄对胚性愈伤组织诱导率的影响 如表1所示，胚龄9 d的鲁原341胚性愈伤组织诱导率最高，可以达到98.5%，其他基因型授粉10 d左右的幼胚最高。13 d的幼胚胚性愈伤组织诱导率很低，最高的齐319也只有76.8%。从表1可以看出，10 d胚龄的幼胚诱导率最高，平均达到88.09%，13 d的最低，平均只有65.90%。胚龄对于胚性愈伤组织的诱导率差异比较显著。从技术的可操作性和培养性状来讲，10 d左右的幼胚一般在1.2～1.5 mm左右，胚性愈伤组织诱导率高，幼胚容易从雌穗上剥离，实验可操作性强。胚龄较大的幼胚在诱导培养基上容易萌发，诱导出的愈伤组织发粘、胚性差、不易继代。

表1 不同基因型玉米幼胚不同生长天数下的胚性愈伤组织诱导率 （%）

2.1.2 基因型对胚性愈伤组织诱导率的影响 从表1的数据和分析中可以看出齐319的胚性愈伤组织诱导率平均最高，达到87.08%，502的最低，只有61.44%。其中502诱导出的愈伤组织大部分发粘，H型胚性愈伤组织少，不易继代培养；齐319与鲁原341诱导的H型愈伤组织多，松脆，淡黄色，胚性好。说明不同的基因型在相同2，4-D浓度的培养基上诱导，胚性愈伤组织诱导率有显著差异，由此看出基因型是影响玉米遗传转化的一个重要因素。

2.1.3 2，4-D浓度对胚性愈伤组织诱导的影响2，4-D对愈伤组织的诱导和生长非常有效，在组织培养中一般用其作为培养基中的生长激素。培养基中2，4-D的浓度对玉米愈伤组织的诱导影响极大。如表2所示，齐319在1.0 m浓度上胚性愈伤组织诱导率最高，达到97.8%，而鲁原341在0.5 mg/L上诱导率最高，达到98.5%。可见2，4-D浓度对玉米幼胚的胚性愈伤组织诱导率有很大影响，而不同基因型的最大诱导率所需的2，4-D浓度也不相同。为防止2，4-D浓度过高影响玉米愈伤组织的分化，诱导培养基的2，4-D浓度最高不超过2 mg/L。

表2 2，4-D浓度对愈伤组织诱导率的影响 （%）

2.2 影响愈伤组织继代的因素

2.2.1 继代时间的影响 愈伤组织在继代的前2～3 d，处于静止生长期，生长缓慢，4～5 d后愈伤组织明显膨大，周缘开始长出米粒状的新愈伤组织，此时生长进入对数生长期，10～12 d以后，愈伤组织生长开始缓慢，进入延迟生长期，此时要进行继代培养。否则愈伤组织容易失去胚性，不易分化成苗。继代时间的长短是愈伤组织能否长期保持胚性的关键因素之一，在对数生长期或对数生长后期进行继代，能够长时间保持愈伤组织的胚性。继代时愈伤组织夹成2～3 mm的小块转移到新的继代培养基上，夹取颜色鲜黄、较脆的胚性愈伤组织进行继代较好。

2.2.2 生长素浓度对继代的影响 继代培养基的2，4-D浓度一般为1 mg/L，愈伤组织生长旺盛，且可以长期保持胚性。2，4-D浓度过高会使愈伤组织受到伤害，同时也可以增加无性系变异2，4-D浓度过低愈伤组织生长缓慢，长势不好，不利于继代。

2.3 影响愈伤组织再生的因素

2.3.1 AgNO3对玉米再生率的影响 试验表明，在培养基上添加8 mg/L AgNO3可以明显提高玉米再生率。当AgNO3浓度高于20 mg/L时，愈伤组织多数出现只长根，不长芽现象，或者只是产生一些胚状根，虽然有绿点，但是无法形成真正的绿苗。

2.3.2 MET对玉米再生苗的影响 由于三角瓶中湿度大，光线弱，培养基营养成分丰富，玉米再生苗在基本培养基上生长快、茎秆细、节间长、叶片发黄、植株弱小、根系不发达、移栽后不易成活。试验发现培养基中添加2 mg/L MET可以有效抑制玉米苗徒长，苗粗壮健康，节间缩短，叶色发绿，根系发达，移栽后容易成活。

3 结论与讨论

（1）在培养基的选择上，主要采用MS和N6培养基，二者对于不同品种和品系玉米愈伤组织的植株再生影响不同。对于诱导产生出胚性愈伤组织，MS比N6效果好，若由幼胚直接再生植株，则N6培养基效果更好，MS与N6的主要区别在于氮源的形式不同。此外激素的选择也影响愈伤组织的生成，2，4-D是影响组织脱分化的关键因素，较高浓度的2，4-D诱导外植体脱分化产生愈伤组织，降低或不加2，4-D愈伤组织才能分化出完整的胚状体，并再生出小植株。在诱导愈伤组织和继代过程中，培养物有三种类型：Ⅰ型：结构紧密，不易分开，这种愈伤组织很容易分化成芽和根或胚状体，但不易继代培养。Ⅱ型：结构松软，白色透明，很容易继代培养，但丧失了分化能力。Ⅲ型：介于Ⅰ型和Ⅱ型之间，具有明显的颗粒状结构，白色或浅黄色，具有分化胚状体的能力，而且又能继代培养。因此，把第三种类型筛选出来，才能使继代培养的愈伤组织保持它的分化能力。

（2）根据玉米愈伤组织的类型，可以挑选合适的愈伤组织进行分化培养。愈伤组织分化是不整齐的，这是因为在愈伤组织继代中并没有进行同步培养有关。分化率的高低与基因型和培养基有很大的关系，而在继代中表现好的自交系其分化率也相对较高。但不同的基因型材料还应进一步作不同培养基的试验，以提高愈伤组织的分化率。所有材料在继代过程中都有分化现象出现，有的出现绿点，应视愈伤组织生长情况及时调整激素浓度及比例，如分化明显，根毛及芽较多应提高2，4-D浓度，降KT或BA浓度，反之则相反。但2，4-D浓度不宜超过4 mg PL，也不能在高浓度2，4-D条件下继代时间过长，一旦受到此影响，材料的分化能力就很难恢复。

（3）本实验所用的4个材料均能诱导出愈伤组织，表明玉米幼胚愈伤组织的诱导具有普遍性，但各个材料问的诱导率差别较大，实验表明基因型对玉米愈伤组织的产生有着重要影响。Spencer等的研究发现，玉米的基因型、幼胚大小及植株的发育状态是影响玉米幼胚培养及植株再生的重要因素，其中玉米的基因型影响特别大。实验也表明浓度对愈伤组织的诱导和生长非常有效，这与王雷等在诱导玉米愈伤组织时的发现一致。中国科学院上海植生所黄璐等认为，2，4-D虽然可以起到诱导的作用，但其对外植体及愈伤组织的伤害作用较大，故诱导时所采取的浓度不易过大，以减少组织培养中的无性系变异。

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