木质素过氧化物酶的研究进展

安徽农业大学动物科技学院 刘海进 李吕木＊

木质素是一类结构复杂、稳定的生物大分子物质，其产量仅次于纤维素（Zyskind和Bernstein，1991）。我国秸秆类物质资源丰富，但木质素约占其20%，由于动物体内缺乏降解木质素的酶类，因此其饲料价值较差。研究表明，通过微生物酶的降解作用，可将饲料原料中的木质素分解为可被动物吸收利用的小分子物质，从而提高其饲用价值 （陈光耀和曹兵海，2003）。木质素过氧化物酶（LiP）是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类，可在木素聚合物内形成自由基，导致键稳定变差从而破坏木质素大分子。本文对近年来关于LiP特性、催化机制、生产及应用等方面的研究进行了综述。

1 木质素过氧化物酶的特性与来源

Kent和Ming等（1983）首次从白腐真菌属的黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的限制性培养基中发现了LiP，并认为其属于氧化还原酶，是真菌分泌的一种含铁血红素的糖基化细胞外蛋白过氧化物酶。研究表明，LiP的糖基化亚铁血红素蛋白质通常以多种复合的形式产生，即含有多种同工酶，分子质量一般在37～47 kDa，经过纯化后的LiP的分子质量在40 kDa左右，等电点为3.5左右，最适酶活温度为35～55℃，最适 pH 为2～ 5（Asgher等，2006）。 LiP氧化还原电位为1.5 V，在H2O2存在时，LiP能氧化分解芳香环多聚体，被认为是木质素降解的关键酶之一。

LiP主要是由微生物分泌所产生，如黄孢原毛平革菌（Phanerochete chrysosoporium）、彩绒草盖菌（Coridusversicolor）、变色栓菌（Thametes versicolor）、 烟管菌 （Bjerkandera adusta）、 射脉菌（Phlebia radiata）、凤尾菇（Pleurotus pulmonanus）朱红密孔菌 （Pycnoporus cinnabarinu）等。Adhi（1989）研究发现，革兰氏阳性菌（Streptomyces viridosporus）T7A 也可产生 LiP。

2 木质素过氧化物酶的催化机制及酶活测定

2.1 催化机制 LiP是一系列含Fe3+、卟啉环和血红素辅基的同工酶。Tien和Kirk（1988）认为，LiP可利用H2O2及有机过氧化物催化一系列底物，其催化作用具有非特异性。Haemmerli等（1986）和Hammel等（1986）研究也发现LiP的作用底物很广泛，主要包括酚类和非酚类芳香化合物，可以氧化木质素单体、二体、三体以及多环芳烃（如苯并芘）等底物。其降解底物的特点为：LiP能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物，在通过电子传递体攻击底物时，能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，将其氧化成自由基，继而以链式反应产生许多不同的自由基，导致底物分子中主要键断裂，然后发生一系列的裂解反应。具体反应机制见图1。

图1 木质素过氧化物酶的催化循环

LiP化合物Ⅰ携带H2O2的两个氧化当量，一个为Fe4+-O中心，另一个形成卟啉的阳离子自由基。基质R被化合物Ⅰ氧化成芳基阳离子自由基，然后通过一系列的非酶反应生成最终的产物。木质素的结构单元之间主要通过醚键（β-O-4）和碳碳键（C-C）的方式连接，LiP通过催化木质素侧链的Cα-Cβ链使其断裂从而降解木质素（Hammel等，1993）。

2.2 酶活测定 LiP酶活的测定主要采用黎芦醇氧化速率法。由于黎芦醇是LiP作用的直接底物，根据310 nm处测得的黎芦醇的吸光度值大小来判定LiP的酶活。具体方法为：1 mL反应液中含0.2 mL藜芦醇溶液、0.4 mL酒石酸缓冲液（250 mmoL/L，pH 3.0）、0.4 mL 培养液或稀释液、20 μL 20 mmoL/L H2O2溶液，于 30 ℃反应 2 min，测定310 nm的吸光度值。在空白组中，以蒸馏水代替H2O2溶液，其他反应物不变。1个酶活单位（U）的定义为每分钟氧化黎芦醇产生1 μmol黎芦醛所需的酶量（Tien和 Kirk，1988）。

3 木质素过氧化物酶的生产

3.1 游离培养木质素过氧化物酶 游离培养LiP合成的主要影响因素为培养基的成分和培养条件（氧浓度）。张红等（2005）在限碳静置、限氮振荡不加藜芦醇的环境下，研究发酵条件对黄孢原毛平革菌合成LiP影响的结果显示：限碳静置培养时，酶活可达1193 U/L，碳源以葡萄糖0.04%和糊精0.16%同时存在比单一葡萄糖作为碳源获得较高的酶活；限氮振荡培养时，所得酶活可达980 U/L。毕鑫等（2003）在静置和振荡两种培养条件下研究营养条件对白腐菌合成LiP影响的结果表明：静置培养时，LiP在碳氮比低的培养基中显示较高的酶活力，碳源以葡萄糖0.02%和糊精0.18%同时存在或分段加入要比单一葡萄糖作为碳源时获得更高的酶活；振荡培养时，在碳氮比高的培养基中LiP酶活最高，而类似于静置培养的氮源组合及分段模式却明显抑制LiP的合成；优化后，静置培养在第6天可获得7560 U/L的酶活，振荡培养在第8天获得6500 U/L的酶活。柯世省等（2000）研究发现，氧浓度对固定化黄孢原毛平革菌合成过氧化物酶影响较大，空气环境下限碳培养黄孢原毛平革菌，其合成的LiP最高活力可达360 U/L，比通纯氧条件下限碳培养时高160%。

3.2 固定化培养木质素过氧化物酶 近年来，采用固定化细胞培养合成LiP已得到了广泛的重视，与游离细胞培养相比，其能更有效地合成LiP。目前已采用多种载体对黄孢原毛平革菌的固定，其中用尼龙网、硅管、聚丙烯、不锈钢、琼脂糖和琼胶颗粒等均取得了较好的效果 （Faison和Kirk，1985）。固定化后的菌丝稳定性增强并且可以重复利用。吴叶明等（2008）用大孔吸附树脂进行黄孢原毛平革菌来源的LiP固定化试验的结果表明，在树脂1.0 g、酶液 pH 4.5、加酶量 87.2 U、吸附温度25℃、吸附4 h、0.2%戊二醛、处理120 min条件下，可获得最佳的固定化效果，固定化酶活可达到16 U/g。刘东华等（2009）通过共价结合法将LiP固定于聚氨酯泡沫上，发现固定化酶活为1.45 U/g（泡沫干重），酶活回收率达到34.79%，提高了固定化LiP的热稳定性，且扩大了固定化LiP稳定性的pH范围，且其重复利用性好。

3.3 利用反应器生产木质素过氧化物酶 目前，有很多关于利用生物反应器生产LiP的报道。由于LiP胞外生产的特点要求，因此除了必须满足菌体需要的营养限制（限碳或限氮）、足够的供氧等环境条件外，还应避免其胞外酶的结构及活性遭受剪切力等因素的破坏。与游离和固定化培养相比，生物反应器有以下几个特点：能够控制内部流体混和均匀、剪切力适宜；为了给细胞生长和目标产物酶的合成提供最佳的环境条件，需要能够对反应器中的pH、温度、溶解氧、氧化还原势、搅拌转速等参数进行测量和控制；必须防止杂菌污染，维持纯种培养等（岑沛霖，2004）。所以利用生物反应器本身的结构和运行参数对其产酶至关重要。

目前主要使用以下几种生物反应器来生产LiP。Couto等（2002）在机械搅拌式反应器中实现了固体培养，LiP酶活均值高达 246.8 U/L。Dominguez等（2001）采用转鼓式生物反应器半浸没培养黄孢原毛平革菌，LiP的酶活达364 U/L。张朝晖等（2003）在三相鼓泡塔反应器中培养黄孢原毛平革菌，在通气量为 1.0 L/（L·min）时，LiP 酶活最高达 367 U/L。Ruggeri和 Sassi（2003）利用滴流床生物反应器间歇培养黄孢原毛平革菌，LiP酶活达1220 U/L。Shim和 Kawamoto（2002）把生长培养基和诱导培养基交替通入到8 L的固定床反应器中间歇培养合成LiP，其最高酶活为1800 U/L。而Gerin等（1997）比较了由气体搅动的气升式反应器、鼓泡式反应器和有螺旋桨搅动的搅拌式反应器后发现，使用气升式反应器LiP酶活的最大值达4500 U/L。综合上述研究可以发现，使用气升式反应器能够获得更高的LiP的酶活。

4 木质素过氧化物酶的应用

4.1 在畜牧生产中 赵红霞等（2002）利用白腐真菌降解秸秆中的木质素和纤维素，使其成为含有酶的糖类，提高了秸秆的适口性，易于消化吸收。Celeux和Lavergne（2005）利用白腐真菌的菌丝分泌的超纤维氧化酶可溶解秸秆表面的蜡质，菌丝进入秸秆内部并产生纤维素酶、半纤维素酶、内切聚糖酶、外切糖酶，从而可降解木质素和纤维素。其中机制可能为LiP和锰过氧化物酶（MnP）在分子氧的参与下，依靠自身形成的H2O2触发启动一系列自由基链反应，实现对木质素无特异性的彻底氧化，使秸秆降解成为含有酶的单糖，从而提高了秸秆的消化性。贾燕南等（2008）研究表明LiP和MnP可降解四环素，且在酶活为40 U/L时，LiP比MnP的降解能力强；对于LiP，当其酶活从15 U/L升高至40 U/L时，四环素降解率提高约15%，当酶活进一步升高至70 U/L时，降解率变化不大。

4.2 其他 LiP在降解有机污染物、生物制浆、处理污染废水等方面还有广泛的应用。张朝晖等（2002）研究表明，黄孢原毛平革菌所产的LiP能氧化多种多氯酚类物质，有些酚类物质常常是广谱生物杀虫剂或除草剂的前体。林鹿等（1996）报道，在LiP单独使用或与其他酶的适当配合处理纸浆，使得制得的纸张具有良好的抗张强度和平滑度，这不仅提高纸张白度而且还降低了纸张的卡伯值。Gary等 （2003）研究发现LiP可以处理2，4-二溴苯酚等工业废水，在氧化的过程中形成二聚体、三聚体和四聚体，从而消除了废水的毒性。

5 展望

农作物秸秆木质素含量较高，难以作为有效的饲料来源。随着对LiP的催化机制、相关基因结构、表达调控等的深入研究，采用优良菌种生产高效的木质素降解酶制剂，对秸秆等潜在饲料资源开发以及废水、废物处理等具有重要意义。

[1]毕鑫，路福平，杜连祥.白腐菌产木素过氧化物酶发酵条件的优化[J].天津轻工业学院学报，2003，18（1）：12 ～ 13.

[2]岑沛霖.生物工程导论[M].北京：化学工业出版社，2004.

[3]陈光耀，曹兵海.牧草对奶牛的生理营养作用[J].中国乳业，2003，3：20～21.

[4]贾燕南，文湘华，李佳喜.木质素降解酶对四环素的降解可行性[J].环境科学学报，2008，281：68 ～ 75.

[5]柯世省，夏黎明，张朝晖，等.氧浓度对固定化黄孢原毛平革菌合成过氧化物酶的影响[J].林产化学与工业，2000，20（3）：40 ～ 45.

[6]林鹿，余家鸾，陈嘉翔.纸浆的酶生物漂白及其机理[J].应用基础与科学工程学报，1996，4：353 ～ 362.

[7]刘东华，张朝晖，吴叶明.黄孢原毛平革菌胞外过氧化物酶系的固定化及性质研究[J].科技通报，2009，25（1）：40 ～ 41.

[8]吴叶明，张朝晖，刘东华.固定化黄孢原毛平革菌木素过氧化物酶的研究[J].纤维素科学与技术，2008，16（4）：12 ～ 13.

[9]张朝晖，邵红，周晓云，等.三相鼓泡塔生物反应器培养黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶系 [J].应用与环境生物学报，2003，9（3）：288～292.

[10]张朝晖，夏黎明，岑沛霖.黄孢原毛平革菌所产木素过氧化物酶系对染料降解的研究[J].环境污染与防治，2002，24（2）：71 ～ 75.

[11]张红，王纯利，冯蕾，等.影响木素过氧化物酶合成和活性的因素研究[J].新疆农业大学学报，2005，28（4）：56 ～ 60.

[12]赵红霞，杨建军，詹勇.白腐真菌在秸秆作物资源开发中的研究[J].饲料工业，2002，23（11）：40 ～ 42.

[13]Adhi T P，Korus R A，Crawford D L.Production of major extra cellular enzymes during lignincellulose degradation by two Streptomycetes in Agitated Submerged Culture[J].Appl and Environmental Microbiology，1989，55：1165～1168.

[14]Asgher M，Shah S A H，Ali M，et al.Decolonization of some reactive textile yes by white rot fungi isolated in Pakistan[J].World J Microbiol Biotechno，2006，122：89（R）～ 9.

[15]Celeux G O，Lavergne C.Mixture of linear mixed models for clustering gene expression profiles from repeated microarray experiments[J].Statistical Modelling，2005，5：1 ～ 25.

[16]Couto S R，Barreiro M，Rivela I，et al.Performance of a solid-state immersion bioreactor for ligninolytic enzyme production：Evaluation of different operational variables[J].Process Biochemistry，2002，38（2）：219 ～ 227.

[17]Dominguez A，Rivela L，Couto S R，et al.Design of a new rotating drum bioreactorforligninolyticenzymeproduction by Phanerochaete chrysosporium grown on an inert support[J].Process Biochemistry，2001，37：549～554.

[18]Faison B D，Kirk T K.Factors involved in the regulation of a ligninase activity in Phanerochaete chrysosporium[J].Appl and Environmental Microbiology，1985，49（2）：299 ～ 304.

[19]Gary W，Yitzhak H，Carlos G，et al.Lignin peroxidase-catalyzed polymerization and detoxification of toxic halogenated phenols[J].Journal of Chemical Technology&Biotechnology，2003，78（12）：1239 ～ 1248.

[20]Gerin P A，Asther M，Rouxhet P G.Peroxidase production by the filamentous fungus Phanerochaete chrysosporium in relation to immobilization in“filtering”carriers[J].Enzyme and Microbial Technology，1997，20 （4）：294 ～300.

[21]Haemmerli S D，Leisola M S，Sanglard D，et al.Oxidation of benzo （a）pyrene by extracellular ligninases of Phanerochaete chrysosporium[J].Journal of Biology Chemistry，1986，261：6900 ～ 6903.

[22]Hammel K，Jensen K A，Mozuch M D，et al.Ligninolysis by a purified lignin peroxidase[J].The Journal of Biological Chemistry，1993，268：12274 ～12281.

[23]Hammel K，Kalyanaraman B，Kirk T.Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons and dibenzo[p]-dioxins by Phanerochaete chrysosporium ligninase[J].Journal of Biology Chemistry，1986，261：16948 ～ 16952.

[24]Kent K，Ming T T.Lignin Degrading Enzyme from the Hymenomycete Phanetochaete chrysosporium Burds[J].Science，1983，221：661 ～ 663.

[25]Ruggeri B，Sassi G.Experimental sensitivity analysis of a trickle bed bioreactor for lignin peroxidases production by P.chrysosporium[J].Process Biochemistry，2003，38：1669 ～ 1676.

[26]Shim S S，Kawamoto K.Enzyme production activity of Phanerochaete chrysosporium and degradation of Pentachlorophenol in a bioreactor[J].Water Research，2002，36：4445 ～ 4454.

[27]Tien M，Kirk K.Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium[J].Methods in Enzymology，1988，161：238 ～ 249.

[28]Zyskind J W，Bernstein S I.Recombinant DNA Laboratory Manual[M].Academimic Press Inc，1991.224 ～ 228.