神经肽Y在鼻息肉组织中的表达及意义

李俊 黄新生 王建中 白广平 石颖*

(1.复旦大学附属中山医院耳鼻咽喉科,上海 200032;2.复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻咽喉科,*病理科,上海 201700)

鼻息肉(nasal polyps)是鼻腔鼻窦黏膜的常见慢性疾病,以极度水肿的鼻黏膜在中鼻道形成单发或多发息肉为临床特征。鼻息肉在人群中患病率较高,尽管Hippocrates已对鼻息肉有过描述[1],但其发病机制至今尚未阐明,因此临床上用药物和手术治疗后仍存在着鼻息肉复发的情况。

近年来随着对鼻黏膜中非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经及其释放的多种神经肽的深入研究以及鼻神经源性炎症[2]概念的提出,越来越多的研究已经证明神经肽的局部释放在调节生理或病理环境下鼻黏膜的血流和腺体分泌中起着重要的作用[3],神经肽的生理或病理作用依赖于肽能神经纤维在正常或病理组织中的具体分布及含量大小。本研究通过免疫组织化学的方法研究神经肽 Y(NPY)在人鼻息肉组织中的分布和含量,以及研究其在正常鼻黏膜组织中的表达差异情况,探讨神经肽Y在鼻息肉发病中的作用,旨在为治疗鼻息肉提供一条新的思路。

1 资料与方法

1.1 材料来源 实验组60例,其中男性36例,女性24例,来源于2007年1月—2009年11月间就诊于我院并初次进行鼻内镜手术的患者,留取鼻息肉标本。根据1997年海口会议慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期标准[4],Ⅱ型1期22例,Ⅱ型2期8例,Ⅱ型 3期 11例,Ⅲ型19例,患者年龄18～67岁,平均年龄39岁。各病例均除外并发哮喘、囊性纤维化和免疫性疾病,且手术前1个月未应用激素、减充血剂和抗组胺药。对照组36例,其中男性10例,女性26例,年龄37～66岁,平均年龄46岁。取同一时期因鼻前庭囊肿切除术中行鼻底引流造孔时取的鼻黏膜,而且全部病例经鼻窦CT证实为非慢性鼻窦炎鼻息肉各型患者。

1.2 实验方法

1.2.1 取材方法 术中所取的鼻黏膜和鼻息肉标本,经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,连续切片4张 ,片厚 5μm。

1.2.2 所需试剂 兔抗人神经肽Y多克隆抗体以及DAB染色试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.2.3 苏木精-伊红染色及病理诊断 具体步骤略,实验组及对照组标本均经病理诊断为鼻息肉或鼻黏膜。

1.2.4 免疫组织化学染色切片脱蜡至水,滴加3%过氧化氢溶液10 min,以阻断内源性过氧化物酶;蒸馏水洗3 min,2次,PBS(pH 7.4)浸泡5 min;必要时进行抗原修复;PBS洗3 min,2次,滴加非免疫的动物血清15 mim。吸取多余液体,增加一抗37度孵育1～2 h,PBS洗3 min,3次;加生物素标记的二抗37度孵育15 min,PBS洗3 min,3次,加链霉素抗生物素过氧化酶(三抗)37度孵育15 min,PBS洗3 min,3次;加DAB显色剂,显微镜下控制反应时间;自来水冲洗,苏木精轻度复染;脱水,透明,中性树胶封片。

1.3 结果分析

1.3.1 定性分析 用已知的阳性片作阳性对照,PBS取代一抗作阴性对照,以排除非特异性染色。棕黄色颗粒为阳性神经纤维或细胞,阳性程度根据染色强度判断。

1.3.2 定量分析 采用BI-2000多媒体彩色病理图文分析系统(成都泰盟科技有限责任公司)对检测结果进行分析。每张切片于100倍视野选取不相重叠的5个阳性部位,在同一标准测量窗下,测量锁定区域内阳性物质的积分吸收度(IOD),取平均积分吸收度值(IODM)为该标本的测量结果。

1.3.3 统计学分析 选用Stata7统计软件,行单因素方差分析或秩和检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色 实验组患者鼻息肉的神经肽Y(NPY)阳性纤维较对照组明显减少并变细,阳性减弱,少量存在于鼻息肉基底部扩张的腺腔、血管周围以及腺泡细胞之间,阳性细胞质内出现较浅的棕黄色颗粒,见图1,2。

2.2 实验组患者鼻息肉的NPY阳性细胞集中部位的平均积分吸收度(IODM)明显低于对照组,见表1,差异有统计学意义。

图1 NPY在鼻息肉中的表达(SP×200)

图2 NPY在鼻黏膜中的表达(SP×200)

表1 两组NPY的IODM比较 ()

表1 两组NPY的IODM比较 ()

注：与对照组比较,*P＜0.05

实验组 60 1427.18±129.54*对照组 36 1846.93±164.35

3 讨 论

鼻息肉的病因和发病机制不明,目前认为是多种机制导致的慢性炎性过程的终末产物。至今已有中鼻道微环境学说、鼻变态反应、嗜酸性粒细胞炎症和细菌超抗原学说等。中鼻道微环境的某些特性,使该部易感性增高。在炎性因子刺激下,上皮细胞和免疫活性细胞合成、释放IL-5及多种炎细胞因子和炎性介质,使嗜酸性粒细胞在局部聚集、释放多种毒性蛋白和细胞因子,致使血管通透性增高,血浆渗出、组织水肿,张力增高,上皮破裂继之增殖,细胞外基质也随之增生,血管、腺体长入,逐渐形成息肉[5]。

目前已经证实人鼻黏膜中不仅存在胆碱能和肾上腺素能神经纤维,还存在非肾上腺素能非胆碱能神经纤维(NANC)[6]。长期以来广大学者认为胆碱能和肾上腺素能神经纤维在人鼻黏膜生理功能中起着主导作用,但是,随着近年来对非肾上腺素能非胆碱能神经以及神经肽的深入研究,越来越多的事实已经证明神经肽的局部释放在人鼻黏膜中起着重要的生理和病理作用[7]。鼻息肉形成的组织病理变化主要为血管扩张、外渗、组织水肿等现象,可用鼻黏膜中的非肾上腺素能非胆碱能神经释放的神经肽来解释[8]。神经肽主要包括P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、血管活性肠肽(VIP)、NPY、一氧化氮合酶(NOS)。NPY是哺乳动物中含量最高,分布最广的神经肽,它属胰多肽相关肽,是一种36肽酰胺,其基因定位于第7号染色体上,包括4个外显子和3个内含子,基因表达受调节神经细胞的各种内分泌因子等很多因素的调节,NPY在鼻黏膜中主要存在于小动脉,少量存在于静脉窦及黏膜下腺体[9]。NPY与NOS共存于NADPH(还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶)阳性神经纤维中[10],有时NPY也与降钙素基因相关肽(CGRP)共存,并发挥收缩血管、调控鼻黏膜的微循环和腺体分泌等作用,具有抑制扩血管物质的作用[11]。Giger等[12]在研究慢性鼻窦炎患者时发现,鼻黏膜中炎症细胞变得更密集而且NPY受体活性降低。Fang等[13]曾在20例患者的鼻息肉组织中发现NPY和血管活性肠肽(VIP)存在表达,而未发现P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)的存在,并据此推测NPY和VIP在鼻息肉形成中可能发挥作用。在麻醉的猪和人的鼻及气管的组胺激发反应试验观察中,有学者[14]发现激活NPY受体可以拮抗由组胺激发的鼻阻力增加、腺体分泌增多等症状,这些症状的病理现象类似鼻息肉形成时的诸如血管扩张、外渗、组织水肿等病理现象。本研究的结果也表明对照组正常鼻黏膜组NPY阳性神经纤维主要分布于小动脉、静脉窦以及腺体的周围,而实验组NPY阳性纤维在鼻息肉组织中分布明显减少,阳性物质颜色较浅,只有少量分布在增生扩张的腺体周围,与各文献报道一致;其在两组中的含量测定采用阳性纤维的平均积分吸收度作半定量分析,本研究发现NPY在实验组鼻息肉组中的含量要明显少于对照组,而且此差异具有统计学意义。因此,NPY在鼻息肉发病中很可能具有重要的作用。

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