高效液相色谱法测定人血浆中头孢地尼的浓度

方阅 郑恒 刘皋林

(1.上海市第一人民医院药剂科,湖北 武汉 200080;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院药剂科,湖北 武汉 430030)

头孢地尼(cefdinir)是口服第3代头孢菌素类抗生素,通过抑制细菌细胞壁的合成而发挥抗菌作用[1]。本品抗菌谱较广,对革兰阳性和阴性细菌均有较好的抗菌作用;另外,头孢地尼对β-内酰胺酶稳定,对一些产酶的细菌也有较好的抗菌作用[2]。因此,检测头孢地尼的药代动力学情况及临床血药浓度的变化,可使临床医师更好掌握最佳的用药时间,最佳、最有效的用药剂量,以及把不良反应降到最低而保持有效治疗作用的最小用药剂量,使其在临床上得到更好、更有效地应用。然而有关头孢地尼血药浓度的测定方法,国内外虽已有相关文献报道,如微生物方法[2]、液质联用法[3]及最先进、最准确的高效液相色谱(HPLC)检测法,但此法检测时间长[5]。为此,本研究建立了一种操作简单、灵敏度高的测定血浆中头孢地尼浓度的HPLC方法,以满足该药的临床药代动力学研究的需要。

1 资料与方法

1.1 药品与试剂 头孢地尼对照品(中国药品生物制品检定所,纯度98.3%);内标甲硝唑对照品(中国药品生物制品检定所,纯度100%);受试药品头孢地尼分散片(规格：0.1 g/片 ;批号：20090201;研制单位：深圳致君制药有限公司);参比药品头孢地尼分散片(规格：50 mg/片;批号：070901;研制单位：天津市中央药业有限公司)。乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司生产);高氯酸(分析纯,中国上海试剂总厂生产);实验用水(Milli-Q超纯水)。

1.2 仪器 高效液相色谱仪器：Waters液相色谱仪;色谱工作站(Empower Build 1154 software);SARTORIUS型 pH计(德国 sartorius公司);YKH-II型液体快速混合器(江西医疗器械厂);TGL-16G台式离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.3 色谱条件 Ultimate C18色谱柱(5 μ m,2504.6 mm);预柱为C18保护柱(43.0 mm I.D.,美国Phenomenex公司);流动相为乙腈：0.025 mol◦L-1磷酸二氢钠缓冲盐溶液(pH 3.24)=15∶85,流速为1.0 mL◦min-1,检测波长为286 nm,进样量为20μL,柱温为35℃。

1.4 对照品溶液的制备 头孢地尼标准溶液的配制：精密称取头孢地尼对照品适量,以甲醇为溶剂溶解,依次定量配制 300、800、3000、8000 、10000、20000、25000 ng◦mL-1标准贮备液,置于-20℃保存。甲硝唑(内标)溶液的配制：精密称取甲硝唑适量,以甲醇为溶剂溶解,定量配制成9600 ng◦mL-1溶液,作为内标贮备液,置于-20℃保存。

1.5 血浆样品预处理 精密吸取血浆200μL,置1.5 mL的离心管中,精密加入20μL内标液(9600 ng◦mL-1),涡旋混匀后,加20μL 35%高氯酸沉淀蛋白 ;涡旋 1 min,以 16600 r◦min-1、4 ℃离心 10 min,取上清液 200μL至自动进样瓶中,取上清液20μL 进行 HPLC测定。

2 结 果

2.1 方法专属性 在本实验所选色谱条件下,头孢地尼和内标峰形良好,其保留时间分别约为7.60 min和6.90 min,且血浆样品经处理后血浆中内源性物质及其他药物不干扰头孢地尼的测定,见图1。

2.2 标准曲线和定量下限 精密吸取空白血浆200μL,精密加入不同浓度的头孢地尼标准溶液20μL,配制成相当于头孢地尼血浆浓度为30、80、300、800、1000、2000、2500 ng ◦mL-1的血浆样品 ,精密加入内标溶液20μL起同样操作;以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值f为纵坐标,对头孢地尼血药浓度做线性回归。其结果表明,血浆中头孢地尼血药浓度30～2500 ng◦mL-1范围内有良好的线性关系,回归方程为Y=0.7934C+0.0021,r=0.9999(n=6);定量下限为30 ng◦mL-1。

2.3 精密度试验 取空白血浆200μL,制备低、中 、高浓度(80、1000、2000 ng◦mL-1)的质控(Qc)样品,连续测定3 d,根据当日标准曲线,计算测得的浓度及精密度。其结果见表1。日内、日间相对标准差(RSD)均＜15%。

2.4 回收率试验 在空白血浆中加入不同浓度标准溶液制备低、中、高浓度的Qc样品,每一浓度制备并测定5个样品。同时用流动相配制相同浓度的的样品,每一浓度测定3个样品。以经沉淀蛋白处理后药物峰面积与相同浓度流动相配置样品直接进样获得的色谱峰面积之比计算绝对回收率。其结果见表1。高、中、低3种浓度绝对回收率均＞60%,回收率良好。

表1 精密度和回收率试验(n=5)()

表1 精密度和回收率试验(n=5)()

浓度(ng◦min/L-1)日内精密度RSD(%)日间精密度RSD(%) 绝对回收率(%)80 3.02 9.00 76.41±6.631000 6.65 6.44 63.78±2.622000 0.97 3.89 66.44±2.29

2.5 稳定性 取空白血浆 200μL,制备低、中、高浓度的Qc样品。分别考察样品在室温放置2 h后、将预处理后的血浆样品在室温放置24 h后、头孢地尼血浆样品经过 3次冷冻(-20℃)-解冻(室温)循环,以及在-80℃下放置30 d的稳定性。结果如表2。

表2 稳定性试验结果(,n=3)

表2 稳定性试验结果(,n=3)

浓度(ng◦mL-1) 室温放置2 h 室温放置24 h 3次冻融 -80℃放置30 d 80 74.00±3.47 79.99±4.65 79.78±2.58 83.72±6.901000 957.43±40.64 965.53±37.56 925.87±76.92 1067.82±17.022000 1982.45±18.27 1806.10±216.30 1754.31±33.62 2031.65±42.52

2.6 生物等效性研究 本生物等效性试验采用2制剂,2周期,随机自身对照交叉试验设计,20名健康男性受试者随机分为2组,分别为受试制组和参比制剂组,每组10人,根据分组结果分别服用受试制剂或参比制剂,其血浆中头孢地尼的平均血药浓度-时间曲线见图2。血浆内源性杂质和其他药物不干扰头孢地尼的测定,因此,本方法符合生物样本的测定要求,可用于头孢地尼血药浓度的测定和临床药代动力学研究。

图1 血浆中头孢地尼和内标的色谱图

图2 20名受试者口服参比制剂和受试制剂后血浆中头孢地尼的平均血药浓度-时间曲线

3 讨 论

头孢地尼血药浓度的测定有微生物法、液质联用法,但是上述方法对仪器要求高,所需成本也高。也有人采用HPLC法,但有样品分析时间过长、样本处理方法繁琐、灵敏度低、回收率低、准确性差及重复性差等问题,很难达到药动学实验所需的检测线。本研究所用HPLC方法对这些问题做了大量的摸索、筛选,在确定内标、选用流动相、净化样品、去除杂质等方面做了改进。首先,在液相条件优化过程中,本研究通过大量实验筛选,最终选择甲硝唑作为内标。甲硝唑在该实验条件下响应值高且稳定,峰形好且不干扰头孢地尼的测定,出峰时间与头孢地尼相近,不影响样本分析的时间。其次,在流动相的摸索过程中,先后选用了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-缓冲盐溶液等作为流动相,发现乙腈-缓冲盐溶液作为流动相较好,在此基础上摸索乙腈和缓冲盐的比例,流动相为乙腈∶0.025 mol◦L-1磷酸二氢钠缓冲盐溶液(pH3.24)=15∶85时,头孢地尼与内标分离好,峰形好且响应高。再次,本方法采用高氯酸直接沉淀除去蛋白,样品处理干净且处理方法简单、快捷,回收率高,灵敏度好。

经过以上改进,本实验条件下的定量下限仅为30 ng◦mL-1,使测得的血药浓度数据更准确,经DAS软件统计的药代参数也更能反映头孢地尼在健康人体内的代谢情况,而且本研究样本分析时间仅为11 min,大大节约了样品分析的时间,适合药代动力学研究大样本分析的需要。

因此,本检测方法操作简单、灵敏、准确、重现性好。在进行药代动力学研究时,无头孢地尼代谢物和血浆中内源性杂质的干扰,测定方法的特异性、精密度、准确度与稳定性均符合生物样本分析的基本要求,本研究建立的HPLC方法适用于头孢地尼血药浓度的测定和药代动力学的研究。

1 Abdel NZ,Franco A,Jamal K.Comparative bioavailability of two cefdinir suspension formulations in middle eastern healthy volunteers after single oral adminisition[J].Antibiotics Antimycotics Antiviral Drugs Chemotherapeutics Cy tostatics,2008,58(3)：149-153.

2 马瑞蓉,张慧琳,侯杰.头孢地尼颗粒剂与胶囊的人体生物等效性[J].中国抗生素杂志,2002,27(11)：677-680.

3 Chen ZJ,Zhang J,Yu JC.Selective method for the determination of cefdinir in human plasma using liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2006,47(2)：163-169.