低氧诱导因子-1基因在宫颈癌组织中的表达及意义

刘红娥 辜为为

低氧诱导因子-1基因在宫颈癌组织中的表达及意义

刘红娥 辜为为

目的研究HIF-1在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭/转移的关系。方法应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法检测56例宫颈癌组织、正常宫颈组织及20例宫颈良性病变组织中HIF-1 mRNA的表达情况，并应用相关统计学方法进行分析。结果HIF-1 mRNA在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达率分别为62.50%、41.07%、35.00%，宫颈癌与正常宫颈组织(P=0.023)、宫颈癌与宫颈良性病变组织(P=0.001)间的HIF-1αmRNA表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的HIF-1αmRNA表达率差异无统计学意义(P=0.091)。HIF-1 mRNA在不同临床分期(P=0.001)及淋巴结转移(P=0.002)中的表达率存在显著差异，但在不同年龄患者的癌组织中HIF-1 mRNA的表达率无差异(P＞0.05)。结论HIF-1 mRNA在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈组织及宫颈良性病变组织。HIF-1与宫颈癌临床分期密切相关，临床分期越晚，其肿瘤组织中HIF-1 mRNA的表达率越高。伴淋巴结转移宫颈癌HIF-1 mRNA表达率高于无淋巴结转移者。HIF-1 mRNA表达率与患者年龄无关。

宫颈癌;低氧诱导因子-1;逆转录聚合酶链式反应

宫颈癌侵袭转移是导致宫颈癌患者死亡的最主要原因。有研究提示低氧诱导因子-1(hypoxia induciblefactor-1，HIF-1)在恶性肿瘤的侵袭转移过程中扮演着十分重要的角色。本研究对HIF-1 mRNA在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达进行检测，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭转移的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 标本均来自我院2005年4月至2008年10月期间住院手术切除的宫颈癌、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织共132例。其中宫颈良性病变组织20例(宫颈糜烂12例、宫颈息肉4例、宫颈肥大4例)、乳腺癌组织(病理证实为鳞状细胞浸润癌及宫颈腺癌)及正常宫颈组织(因子宫肌瘤行子宫全切患者)各56例。根据2000年国际妇产科联盟(FIGO)宫颈癌分期，0期6例，Ⅰ期31例，II 14例，Ⅲ期5例;伴淋巴结转移36例，无淋巴结转移20例;全部患者术前均未行任何抗癌治疗。所有患者均为女性，宫颈癌患者平均年龄47岁(19～78岁);宫颈良性病变患者平均年龄32岁(22～41岁)。

1.2 RNA提取 按Trizol试剂盒说明书提取组织总RNA:取100 mg冻存的组织标本，加入lml Trizol试剂研磨至浆液，室温静置5 min。加入0.2 ml氯仿快速剧烈摇15 s，室温静置2～3 min，于4℃12000 r/min离心15 min。将上层移至另一EP管中，加入0.2 ml异丙醇和0.2 mlRNA沉淀液，轻柔混匀，室温静置10 min，4℃离心12000 r/min离心10 min，弃上清。用冰冷的75%乙醇lml洗RNA沉淀1～2次，于4℃7500r/min离心 5 min;弃上清，室温凉干5～10 min，溶于40μlDEPC水中。RNA的定量与鉴定，取2 μl RNA用DEPC处理水稀释250倍，混匀后用大型多功能分光光度计测其260 nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280比值及RNA含量。RNA样本用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 逆转录反应 在20 μl的反应体系中加入5×reaction buffer4 μl，oligo(dT)18 Primer(0.5 μg/μl)1 μl，RiboLock TM Ribonuclease inhibitor(20 U/μl)1 μl，10 mM dNTP 2 μl，总RNA2 μg，逆转录酶 M-MLV1 μl，DEPC 水补齐至 20 μl，42℃孵育60 min(逆转录)，72℃孵育10 min以终止反应，于冰上降温(灭活逆转录酶)。

1.4 PCR反应 扩增HIF-1基因的引物序列，上游引物:AGAAACCACCTATGACCTGC，下游引物:GTCGTGCTGAATAATACCACTC，扩增产物长度410bp，β-actin为内参照，上游引物:CAACTTCATCCACGTTCACC，下 游 引 物:GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，扩增产物长度268bp。25μl的反应体积中加入 cDNA2 μl，LOX 上、下游引物各 1μl，PCR Master Mix12.5μl，去离子水8.5μl混匀后，置于 PCR 仪中，反应条件:95℃预变性10 min 后，95℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，40 个循环，最后72℃ 延伸10 min。

1.5 PCR产物鉴定 用1.0%琼脂糖凝胶将提取的RNA进行电泳，在紫外线灯下观察。

1.6 统计分析 计数资料采用χ2检验及四表格确切概率法，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 HIF-1 mRNA在宫颈癌、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达 HIF-1 mRNA在宫颈癌组织中的表达率为62.50%，而在正常宫颈组织和宫颈良性病变组织中的表达率分别为41.07%、35.00%(图1、图2、图3)。经统计学分析，宫颈癌与正常宫颈组织(P=0.023)、宫颈癌与宫颈良性病变组织(P=0.001)间的HIF-1 mRNA表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的HIF-1 mRNA表达率差异无统计学意义(P=0.091)。见表1。

2.2 HIF-1 mRNA与临床病理特征的关系 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌 HIF-1 mRNA表达率分别为 50.00%、41.93%、100.00%、100.00%，统计学分析，Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌HIF-1 mRNA的表达率明显高于0、Ⅰ期(P=0.001);伴淋巴结转移宫颈癌HIF-1 mRNA表达率为77.77%，明显高于无淋巴结转移的35.00%(P=0.002);在19～50岁、＞50岁的患者中，HIF-1 mRNA的表达率分别为60.00%、66.66%，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 HIF-1 mRNA在宫颈癌、正常宫颈组织及良性病变组织中的表达

表2 HIF-1 mRNA与临床病理特征的关系

3 讨论

HIF-l基因定位于人类染色体14q21-q24，属于bHLH-pas蛋白家族，由120kD的α亚基(HIF-1α)和91/93/94kD的β亚基(HIF-1β)组成。HIF-1α是唯一的氧调节亚单位，通过泛素、蛋白酶体途径降解，缺氧降低泛素化或通过突变阻断泛素化而增加HIF-1α的表达［1］。缺氧条件下，由于降解通路被阻断，HIF-1α迅速与HIF-1β聚合形成有活性的HIF-1二聚体，通过激活其下游靶基因的转录实现其生理学效应［2］。HIF-l与靶基因中的HIF-1结合点结合，促进其转录，引起一系列细胞对缺氧的反应［3］。HIF-1在肿瘤中的生物学功能有促进糖酵解;促进新生血管生成;参与肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡;参与红细胞生成及铁代谢［4］。

在本研究中，HIF-1 mRNA在正常宫颈组织及宫颈良性病变组织的表达率分别为41.07%、35.00%，且差异均无统计学意义，提示HIF在宫颈良性病变的发生中作用并不十分明显。而在宫颈癌中HIFmRNA高达58.92%，高于正常宫颈组织及良性病变组织，表明HIF-1的过度表达与宫颈癌的发生有关。HIF-1在不同临床分期患者中的表达不完全相同，Ⅱ期、Ⅲ期宫颈癌患者癌组织中的表达率较0期、Ⅰ期患者升高。该实验结果反映出HIF-1 mRNA表达的变化趋势，即随着宫颈癌病情的进展，HIF-1 mRNA的表达率呈上升趋势。在伴有淋巴结转移的患者中HIF-1 mRNA的表达率明显高于无淋巴结转移患者，提示HIF可能与宫颈癌发生淋巴结转移有关。目前公认肿瘤组织中氧含量的降低是促进肿瘤转移的主要原因之一，这也可能是HIF-1参与肿瘤侵袭转移的主要原因［5］。而HIF-1 mRNA在不同年龄组的宫颈癌患者中的表达率在统计学上无显著差异(P＞0.05)，表明HIF-1与患者年龄无关。

以上研究表明HIF-1 mRNA在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈组织及宫颈良性病变组织。HIF-1 mRNA与宫颈癌临床分期密切相关，临床分期越晚，其肿瘤组织中HIF-1 mRNA的表达率越高。伴淋巴结转移宫颈癌HIF-1 mRNA表达率高于无淋巴结转移者。HIF-1 mRNA表达率与患者年龄无关。

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Expression of Hypoxia induciblefactor-1 Gene in cervical cancer and its clinical significance

Objective To study the expression of HIF-1 in human cervical cancer and explore the relationship between HIF-1expression and clinical pathological features(patient’s age，limph node metastasis，clinical stage，).MethodsThe expression of HIF-1 mRNA in 56 cases of human cervical cancer tissues，normal cervical tissues and 20 cases of cervical benign lesion tissues was detected by reverse transcriptase polymerase chainreaction(RT-PCR).ResultsThe expression rate of HIF-1 mRNA in cervical cancer，normal cervical tissues and cervical benign lesion tissue were 62.50%、41.07%、35.00% ，statistical difference was found among cervical carcinoma group，normal cervical tissues group and benign lesion group.The expression of HIF-1 mRNA were associated with clinical stage(P=0.001)and lymph node metastasis(P=0.002)，but had no correlation with age and tumor size(P＞0.05).ConclusionHIF-1 mRNA expression is increased in cervical cancer tumor tissues compared with normal tissues and cervical benign lesion tissue，HIF-1 is relevant with the occurrence of cervical cancer.The cervical cancer cells proliferation capacity is increase，degree of malignancy is higher and facilitates metastasis occurred which HIF-1 is expressed.

Cervical cancer，HIF-1，RT-PCR

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