人参皂苷对重度颅脑外伤大鼠模型环氧合酶－2表达的影响＊

李永领 项洪武 朱烈烈 陈大庆

人参皂苷对重度颅脑外伤大鼠模型环氧合酶－2表达的影响＊

李永领 项洪武 朱烈烈 陈大庆

目的 观察人参皂苷对重度颅脑外伤大鼠模型环氧合酶(cyclooxgenase－2，COX－2)mRNA表达的影响。方法选取健康wistar大鼠56只，分为正常对照组、模型组和人参皂苷组，Feeney法制作重度颅脑外伤模型，人参皂苷组在造模前30min按5mg/kg灌胃人参皂苷。造模后6、24、72h共3个时相点取各组大鼠脑组织，应用RT－PCR法检测各组神经细胞COX－2 mRNA的表达。结果正常对照组未见COX－2 mRNA的表达;模型组和人参皂苷组脑外伤后6h出现COX－2 mRNA的表达，24h达到高峰，72h后明显减少;人参皂苷组各个时间点COX－2 mRNA的表达明显低于模型组。结论重度脑外伤存在COX－2 mRNA的异常表达，人参皂苷能抑制COX－2 mRNA的表达，可能对脑外伤有一定的保护作用。

人参皂苷 重度颅脑外伤 环氧合酶－2

温州医学院附属第二医院(温州325027)

＊温州医学院附属第二医院院级课题(No.2007yy13)

重度颅脑外伤有着较高的致残率和死亡率，随着研究的深入，对颅脑外伤后继发性脑损伤在创伤后病理生理过程中的认识也逐步加深，其中炎症是继发性脑损伤的一个重要组成环节。环氧合酶－2(cyclooxgenase－2，COX－2)是花生四烯酸代谢的限速酶，后者产生的前列腺素及血栓素是脑创伤后炎症级联反应的重要介质。本研究观察大鼠重度颅脑外伤后COX－2 mRNA的表达变化及人参皂苷对其的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:健康雄性wistar大鼠56只(温州医学院实验动物中心)，体质量170～250g。试药:人参皂苷购自上海市药品检验所，纯度94.7%;Trizol液购自加拿大BBI公司;MMLV逆转录酶购自日本TOYOBA公司;引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。PCR Master Mix试剂盒购自美国Promega公司。仪器:高速低温离心机(Allegra64R Centrifuge，美国Beckman公司);低温冰箱 (R－404A，美国Forma Scientific公司);PCR仪(GeneAmp9600，美国Perkin Elmer公司);紫外透射反射仪(FS－312，上海复生生物工程研究所);凝胶成像系统(Gene，USA)及Scanband图像分析软件系统。

1.2 分组及建模 56只大鼠随机分为正常对照组8只，模型组24只，人参皂苷组24只(术前30min按5.0mg/kg灌胃人参皂苷溶液)。模型组及人参皂苷组以5%氯胺酮80～100mg/kg腹腔内注射，将麻醉后的大鼠俯卧固定于自制的简易落体致伤装置。参照Feeney法[1]将顶部皮肤矢状切开，在“人”字缝前3mm、中线右3mm顶部颅骨钻孔并扩大骨窗(直径5mm)，不越过中线，暴露硬膜，将底面直径3mm的致伤撞垫轻轻置于骨窗中央的硬膜上，用20g重物自40cm高处沿滑杆垂直落下打击撞垫(冲击力为800g·cm)，造成大鼠右顶叶局限性脑挫裂伤，间断缝合头皮，整个过程均无菌操作。于术后6、24、72h分别将大鼠处死，无菌下开颅取部分外伤脑组织，－70℃保存备测。

1.3 RT－PCR法 用Trizol一步法提取细胞总RNA。逆转录体系为 20μL: 细胞总 RNA3μL(2.5～3μg)，10U/μL RNAsin 1μL，5 ×逆转录反应缓冲液 4μL，10μmol/L dNTP 2μL，25pmol/μmL随机引物1μL，MMLV逆转录酶100U，25mmol/L MgCl2 0.5μL。30℃反应 10min，42℃反应 20min，99℃反应 5min，终止反应。引物根据软件Oligo6.0设计。COX－2上游引物:5'－ACG GAC TTG CTC ACT TTG－3'，下游引物:3'－CAT TAG GGT AGA CAA GAG－5';扩增片段长度376bp。内参照β－肌动蛋白上游引物:5'－ACG TTG ACA TCC GTA AAG －3'，下游引物:3'－CGG AGT GAC AGG TGG AAG－5';扩增片段长度200bp。PCR扩增体系为 25μL:逆转录产物 2μL(0.1 ～2μg)，10pmol/μL 上、下游引物各 2.5μL，PCR Master Mix12.5μL，其余以无核酶水补足至25μL。扩增条件:94℃反应10min，94℃反应45s，58℃反应1min，72℃反应1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(80V，35min)后，紫外透射仪下观察并照相，在凝胶上进行扫描定量，以目的基因与内参照的荧光比值代表mRNA的表达水平。

2 结果

见图1、表1。模型组和人参皂苷组各个时相点均可见COX－2 mRNA的表达。正常对照组未见COX－2 mRNA的表达，模型组脑外伤后6h出现COX－2 mRNA的表达，24h达到高峰，72h后明显减少，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);人参皂苷组各个时间点COX－2 mRNA的表达均低于模型组(P ＜ 0.05)。

3 讨论

人参总皂苷含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1等主要活性成分，具有改善微循环、抗自由基、阻止钙离子内流和抑制炎症反应多重作用[2]。

表1 各组COX－2 mRNA表达比较 (±s)

表1 各组COX－2 mRNA表达比较 (±s)

与正常对照组比较，＊P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05

伤后24h 伤后72h组 别正常对照组模型组人参皂苷组n 8 2 4 24伤后6h 0.0000 ± 0.0000 0.0602 ± 0.1301＊0.0421 ±0.1001＊△0.1462 ±0.1002＊△0.0903 ±0.0921＊△0.1027 ± 0.0832＊0.0804 ± 0.0975＊△

图1 COX－2 mRNA在实验组中的表达

在生理状态下，COX－2在大多数组织中以极低拷贝数表达。但脂多糖、白细胞介素－1、肿瘤坏死因子、血清、表皮生长因子α和血小板活化因子等许多炎症刺激因子均可诱导COX－2的基因表达，参与炎症反应和多种疾病的病理过程，且蛋白合成抑制剂不能抑制COX－2 mRNA的表达，因此COX－2是一种即时基因。COX－2主要存在于神经细胞。脑损伤时，COX－2及其代谢产物至少可在脉管系统、血脑屏障和神经元本身3个环节加重脑损伤。本研究结果显示正常脑组织中未见COX－2 mRNA的表达，脑外伤后6h出现COX－2 mRNA的表达，24h达到高峰，72h后COX－2的表达明显减少。Strauss等[3]应用免疫斑点技术对大鼠脑损伤后COX－2蛋白表达研究发现，脑损伤后损伤区脑皮质COX－2表达在1d时显著增加，3d达高峰。而海马区COX－2表达脑损伤后2h开始增加，1d达高峰，3d下降至正常水平。Strauss等[3]应用原位杂交技术对脑损伤COX－2 mRNA含量进行研究时还发现，外伤后2～6h COX－2 mRNA含量在皮质及海马均开始增加，24h达高峰，72h时仍高于正常水平。Kunz等[4]对外伤后COX－2 mRNA含量的研究结果与Schwab等[5]相似。这种变化趋势与本研究结果一致。

本研究还发现，人参皂苷组各个时相点COX－2 mRNA的表达均低于模型组，说明人参皂苷能明显抑制这种异常表达。因COX－2是催化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，而前列腺素是非常重要的炎性因子，故通过抑制COX－2活性可有效地降低炎性反应。因此，在脑外伤早期应用人参皂苷，对重型脑外伤可能具有保护作用。

[1]Feeney.D M，Boyeson M G，Linn R T，et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res，1981，211(1):67 －77.

[2]吴晓燕.人参总皂苷对大鼠缺血再灌注后神经元凋亡的保护及作用机制的研究 [J].神经疾病与精神卫生，2005，5(5):347－350.

[3]Strauss K I，Barbe M F， Marshall R M， et al.Prolonged cyclooxygenase－2 induction in neurons and glia following traumatic brain injury in the rat[J].J Neurotrauma， 2000， 17(8):695 －711.

[4]Kunz T， Marklund N， Hillered L， et al. Cyclooxygenase－2，prostaglandin synthases，and prostaglandin H2 metabolism in traumatic brain injury in the rat [J].J Neurotrauma， 2002， 19(9):1051－1064.

[5]Schwab J M， Beschorner R，Meyermann R，et al.Persistent accumulation of cyclooxygenase－ 1－expressing microglial cells and macrophages and transient upregulation by endothelium in human brain injury[J].J Neurosurg， 2002， 96(5):892 － 899.

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1004－745X(2010)09－1556－02

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