MDR1C3435T基因多态性与抗癫痫药卡马西平疗效的相关性研究

郭桂梅, 郭颖杰, 林卫红, 孟红梅

卡马西平(carbamazepine,CBZ)是一种传统的抗癫痫药,但临床上发现应用该药后个体差异较大,推测可能与基因多态性有关。多药耐药(MDR1)基因编码的 P-糖蛋白具有能量依赖性药物泵的功能,多种抗癫痫药(包括卡马西平)已被证实为 P-糖蛋白的底物,本研究选择 MDR1C3435T位点,采用多聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性法(PCR-RFLP法)检测癫痫患者 MDR1基因 C3435T位点的基因型,探讨 MDR1C3435T基因多态性与CBZ的疗效及浓度之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究收集 80例服用卡马西平的癫痫患者,其中男性 46例,女性 34例,年龄在16～73岁之间,体重在 40～77kg之间。发作类型:全面性发作 19例,部分性发作 61例。

1.2 测定血药浓度 正规口服给药,至少服用1w即血药浓度达到稳态(5～7个血浆半衰期),清晨空腹抽取静脉血,测定血药浓度。CBZ血药浓度测定全部在吉林大学第一医院检验科进行,检测方法采用 Dimension临床生化系统及 CRBM Flex试剂盒(颗粒增强比浊度免疫抑制测定技术)。CBZ有效血药浓度范围是 4～12μg/ml。

1.3 提取 DNA留取上述每位癫痫患者的外周静脉血 4ml,注入到 2%乙二胺四乙酸(2%EDTA)抗凝管中,采用全血基因组 DNA纯化试剂盒从中提取全血基因组 DNA。为防止环境 DNA污染和样品交叉污染,提取时设空白对照。

1.4 PCR-RFLP法检测 MDR1C3435T的多态性

1.4.1 PCR引物序列 正向引物 5'-TGTTTTCAGCTGCTTGATGG-3';反向引物 5'-AAGGCATGTATGTTGGCCTC-3'。

1.4.2 PCR反应体系 10×PCR缓冲液 5μl;dNTP 1μl;正向引物 0.7μl;反向引物 0.7μl;Taq酶0.4μl(5U/μl);DNA模板 3μl;灭菌双蒸水 39.2μl。

1.4.3 PCR程序 起始变性:95℃ 2min;95℃45s,56℃ 45s,72℃ 30s,3次循环;95℃ 45s,55℃45s,72℃ 30s,5次循环;95℃ 45s,54℃ 45s,72℃30s,26次循环;最后延伸:72℃10min。之后经 3%琼脂糖凝胶电泳 30min,凝胶成像系统观察并保存图像。

1.4.4 酶切法测定基因型 PCR扩增产物为197bp,经限制性内切酶 BfuCⅠ37℃消化 4h。反应体系:10×NEB缓冲液 2μl;PCR扩增后基因片段10μl;100×BSA 0.2μl;BfuCⅠ 0.5μl;灭菌双蒸水7.3μl。切割产物经 3%琼脂糖凝胶电泳 45min,凝胶成像系统观察并保存图像。

1.4.5 结果评定 PCR扩增产物为 197bp,由于 MDR1第 3435位碱基 C到 T的突变使 BfuCⅠ酶切位点消失,经限制性内切酶 BfuCⅠ酶切后,等位基因 C产生 158bp和 39bp 2个片断,而等位基因 T不被切割,仍为 197bp 1个片段。故 CC基因型有158bp和 39bp 2个片断,CT基因型有 197bp、158bp和 39bp 3个片段,TT基因型有 197bp 1个片段。

1.4.6 统计学分析 全部数据采用 SPSS11.5统计软件进行统计学处理,验证数据符合正态分布及方差齐性后,采用 t检验或方差分析对血药浓度及剂量进行比较,采用 χ2检验对疗效及基因型频率进行比较。

2 结 果

2.1 CBZ疗效 有效组(正规服用卡马西平后发作频率减少达到 50%者)有 49例;耐药组(发作频率减少未达到 50%)有 31例[1～3]。血药浓度均在正常范围内。

2.2 PCR扩增后产物和 BfuCⅠ酶切后产物MDR1C3435T基因经 PCR扩增后,应用 3%琼脂糖凝胶电泳分离,得到的扩增片段为 197bp(见图1),最右边泳道为 Marker。扩增后产物经 BfuCⅠ酶切后,CC基因型得到 158bp和 39bp 2个产物,TT基因型仅得到 197bp 1个产物,CT基因型得到 197bp、158bp和 39bp 3个产物;由于 39bp这一片段太小,经电泳后已泳至凝胶外,故凝胶图片中 CC基因型和 TT基因型各显示一条带,CT基因型显示 2条带(见图2)。

2.3 有效组与耐药组基因型比较 有效组患者基因型:CC基因型 20例(频率为 40.82%),CT基因型 18例(频率为 36.73%),TT基因型 11例(频率为 22.45);耐药组患者基因型:CC基因型 7例(频率为 22.58%),CT基因型 15例 (频率为48.39%),TT基因型 9例(频率为 29.03%),其中有效组 CC基因型出现频率较高。两组基因型比较进行 χ2检验,χ2=2.825,P=0.244,无统计学差别。

2.4 不同基因型患者血药浓度的比较 CC基因型患者血药浓度的均值为 7.16±2.31μg/ml,CT基因型为 7.56±1.97μg/ml,TT型为 7.20±2.29 μg/ml,发现 CT基因型患者血药浓度略高,对 3者的比较进行方差分析 F=0.18,P=0.836,无统计学差别。

图1 MDR1第 3435位分型PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

图2 MDR1第 3435位分型 PCR扩增产物酶切后琼脂糖凝胶电泳图,1、2、7、9泳道为 CC基因型;3、5为 CT基因型;4、6、8为 TT基因型;11为 Marker

3 讨 论

MDR1基因产物 P-糖蛋白是一种跨膜糖蛋白,位于细胞膜上,分子量为 170kB,由 1280个氨基酸组成,氨基端与羧基端氨基酸序列对称,同源性高达78%,每部分各有 6个跨膜区和一个ATP结合位点。跨膜区作为膜通道有利于物质转运,ATP结合位点位于细胞内,为物质转运提供能量。P-糖蛋白能与药物结合,同时结合ATP,利用ATP水解释放的能量将药物转运到细胞外,使细胞内药物浓度下降,其细胞毒作用因而减弱或完全丧失,细胞由此产生耐药性。P-糖蛋白的底物谱较为广泛,目前为止,很多临床常用药物都已被证实是 P-糖蛋白的底物,包括多种 AEDs如卡马西平、加巴喷丁、托吡酯、苯妥英钠、苯巴比妥、拉莫三嗪等。因此,P-糖蛋白是影响体内药代动力学和药物相互作用的重要蛋白,尤其是对作用于中枢神经系统的药物,血脑屏障上的 P-糖蛋白及其他外向转运蛋白对药物在脑组织的分布存在着重要影响。

编码 P-糖蛋白的 MDR1基因位于人类第 7号染色体上,其具有多态性,C3435T位于 MDR1第 26位外显子上,这一位点等位基因为 C,当其发生突变时被等位基因 T所代替。目前认为这一位点多态性与P-糖蛋白的表达水平及功能有关[4～7]。其机制可能通过与临近的 SNPs连锁进而影响 P-糖蛋白的表达和功能,但其具体的关系仍未得到统一的结果。有的研究结果显示 TT基因型携带人群 P-糖蛋白表达水平较 CC基因型携带人群低,导致转运细胞内药物的能力也较弱,血药浓度高,认为 CC基因型是癫痫患者耐药性的一种相关性因素[5,6,8,9];有的研究显示相反的结果[7,10]。出现上述各种不同的结论,可能与种族差异、试验方法、样本数量等因素有关。由于 MDR1C3435T位点存在多态性,且其多态性影响 P-糖蛋白已得到公认,所以本研究选择MDR1C3435T基因位点。

以往有关于 MDR1C3435T基因多态性与 CBZ浓度和疗效关系的研究较少。Ozgon等[11]观察了97例服用 CBZ的癫痫患者,对照组为 174例健康受试者,结果发现该基因与 CBZ剂量和浓度无特定关系。Seo等[10]收集 210例服用 CBZ的癫痫患者,对其进行基因分型,检测血药浓度,得出了不同的研究结果,同时发现 C3435T基因多态性并没有影响 CBZ的血药浓度。

本研究主要是探讨 MDR1C3435T基因多态性与抗癫痫药 CBZ血药浓度及疗效的关系。通过对80例服用 CBZ的癫痫患者进行观察,测定血药浓度,根据发作频率减少程度将其分为有效组和耐药组,并采用 PCR-RFLP法对其 MDR1C3435T位点基因型进行检测,分别对不同疗效组的基因型及血药浓度和不同基因型的疗效及血药浓度进行比较。在血药浓度正常的情况下,对有效组与耐药组的基因型进行比较,发现有效组的 CC基因型的频率较高,但无统计学差异,与 Ozgon等[10]的研究结果相同。同样本研究排除由于剂量差异所导致不同基因型血药浓度及疗效的差异,对 3种基因型患者的 CBZ血药浓度的比较结果,CT基因型的血药浓度较高,但与其他两种基因型相比无显著性差异,与 Seo等[10]的研究结果相同。同时发现 CC基因型患者的有效率较高,但 3种基因型有效率的差异无统计学意义。由此可见采用 PCR-RELP技术显示 MDR3435T基因多态性与抗癫痫药 CBZ的血药浓度及疗效没有明显相关性。为探讨基因多态性与抗癫痫药物疗效的相关性,需对其他基因位点进行深入研究。

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