结肠癌CA-Ⅱ的表达及其临床意义

王贵红，郑兰东

（河南大学第一附属医院普通外科，河南开封 475001）

结肠癌CA-Ⅱ的表达及其临床意义

王贵红，郑兰东

（河南大学第一附属医院普通外科，河南开封 475001）

目的：探讨结肠癌中碳酸酐酶-Ⅱ（CA-Ⅱ）的表达与肿瘤的侵袭、转移和生物学行为的关系。方法：采用免疫组化SP法测定40例结肠癌中CA-Ⅱ基因导入到结肠癌细胞中，观察细胞生物学行为的改变。结果：CA-Ⅱ在癌旁正常组织中表达阳性率为100%，在结肠癌组织中表达阳性率为30%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。结肠癌组织中CA-Ⅱ的表达与年龄、性别无关（P＞0.05）；与组织分型、分化程度和淋巴结转移呈正相关（P＜0.05）。将CA-ⅡcDNA克隆转染HR-8384细胞后，癌细胞侵袭、趋化运动能力及耐受性均明显减弱。结论：CA-Ⅱ在结肠癌中的表达影响肿瘤侵袭、转移和生物学行为。

结肠癌；碳酸酐酶－Ⅱ；肿瘤

碳酸酐酶Ⅱ（CA-Ⅱ）是含锌金属酶－碳酸酐酶家族中的一员，因其分布广泛、较高的催化效率和重要的生理学作用，目前已成研究的热点。但关于CA-Ⅱ与结肠癌之间关系的研究甚少。本研究采用免疫组化SP法，观察结肠癌和癌旁正常组织中CA-Ⅱ的表达情况，以及CA-Ⅱ与临床病理因素之间的关系，同时研究CA-Ⅱ对结肠癌细胞生物学行为的改变，从而为筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本院2009年8月～2010年3月手术切除结肠癌标本40例，其中，男22例，女 18例；年龄 45～82（平均 62）岁。 术后病理报告：乳头状腺癌23例，管状腺癌11例，黏液癌4例，未分化癌2例。高、中分化癌16例，低、未分化癌24例。淋巴转移21例，无淋巴结转移19例。术前均未作放、化疗。癌旁正常组织作为对照。

1.2 免疫组织化学染色

采用免疫组化SP法，DAB染色。CA-Ⅱ多克隆抗体（兔抗人）购自Santa Cruz公司。SP试剂盒购自美国Zymed公司。工作浓度为1∶100。用已知的结肠癌CA-Ⅱ阳性切片作阳性对照，用PBC代替－抗作阴性对照。按照SP试剂盒所附的说明书进行操作。

1.3 免疫组化结果的判断

CA-Ⅱ阳性标准为细胞膜染成棕黄色或棕褐色，取染色明显的部位，高倍镜下取4个不同视野连续计数200个细胞。判断如下：阳性细胞数＜25%或无显色为（－），25%～50%（＋），＞50%（++）。

1.4 细胞转染

用常规逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法从正常结构黏膜组织和淋巴结转移中克隆CA-ⅡcDNA，构建真核表达载体PCDNA3.1－CA-Ⅱ。采用脂质体转染法将PCDNA3.1－CA-Ⅱ转染结肠癌HR－8384细胞。

1.5 观察结肠癌细胞生物学行为的改变

1.5.1 肿瘤细胞的侵袭能力 细胞侵袭基底膜实验在Transwell小室（Costar公司）中进行。统计视野中的细胞数目，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.5.2 肿瘤细胞的趋化运动能力 在聚脂酸滤膜（8 μm孔径）上下表面分别覆盖5 μm纤粘连蛋白（promege公司），黏附于Transwell小室。细胞株经EDTA/PBS消化后约2.5×105个细胞进入到Transwell小室中，统计视野中的细胞数目，以细胞的相对数目表示肿瘤细胞的趋化运动能力。

1.6 四唑盐比色试验（MTT）

以转染PCDNA3.1－CA-Ⅱ的细胞为实验组；以未转染PCDNA3.1－CA-Ⅱ的细胞为对照组。分别观察氟尿嘧啶及奥沙利铂药物对其的抑制率。抑制率＝（1－实验组吸光度值/空白对照组的光度值）×100%。

1.7 统计学处理

采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CA-Ⅱ在结肠癌组织中的表达

CA-Ⅱ在结肠癌组织中的表达阳性率为30%，阴性率为70%。癌旁正常组织中的阳性表达率为100%，二者差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 CA-Ⅱ在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达（n）

2.2 结肠癌组织CA-Ⅱ的表达与临床病理因素之间的关系

结肠癌组织中CA-Ⅱ的表达阴性率与年龄、性别无关（P＞0.05），与组织分型、分化程度和淋巴结转移呈正相关（P＜0.05），见表 2。

表2 结肠癌组织CA-Ⅱ的表达与临床病理因素之间的关系（n）

2.3 转染CA-Ⅱ癌细胞的侵袭和趋化运动能力

转染CA-Ⅱ癌细胞的侵袭能力、趋化运动能力较未转染癌细胞明显下降（P＜0.05），MTT实验显示氟尿嘧啶和奥沙利铂对转染CA-Ⅱ的癌细胞的抑制率较未转染癌细胞明显增强（P＜0.05）。

3 讨论

CA-Ⅱ是一个28KD的胞浆内酶，分布广泛，几乎在所有组织或器官的细胞浆内均有表达[1]。在结肠组织中，它定位于结肠的内皮和上皮细胞，促进远端结肠上皮分泌——H+和HCO3-，有利于机体水、电解质及酸碱平衡。同时，CA-Ⅱ可导致肿瘤细胞功能紊乱，甚至肿瘤细胞的死亡[2]。若缺乏CA-Ⅱ，肿瘤组织中pH值下降，氧分压降低，肿瘤细胞代谢障碍，导致肿瘤细胞呈失控性生长[3]。因此，CA-Ⅱ通过改变肿瘤细胞的微环境，如pH值下降、水电解质及酸碱平衡失调或低氧分压等，影响代谢过程（如糖原合成，脂肪酸和氨基酸的合成等），从而成为抗肿瘤因子—抑瘤基因[4]。同时研究发现大肠癌组织CA阳性组的预后明显好于阴性组[5-6]。因此有学者提出CA-Ⅱ可作为一种肿瘤标志物[7]。

本研究发现CA-Ⅱ在结肠癌组织中的表达阳性率为30%，阴性率为70%，而癌旁正常组织中的表达阳性率为100%，说明CA-Ⅱ在结肠癌级织中的表达下降。同时，还发现CA-Ⅱ的表达阴性率与组织学分型、分化程度和淋结转移有关联。为了进一步证明CA-Ⅱ可能为一种高癌基因，笔者采用转染方法，将转染CA-Ⅱ基因的结肠癌细胞和未转染细胞分别观察肿瘤细胞的侵袭能力、细胞趋化运动能力以及对抗癌药物的反应发现二者有明显差异。

这进一步证明CA-Ⅱ的表达与结肠癌的侵袭、转移和生物学行为密切相关，CA-Ⅱ在抑制结肠癌发生、发展中发挥着重要作用。这与碳酸酐酶既可作为筛选结肠癌的有用指标，又与碳酸酐酶可用于防治结肠癌的复发转移的研究相一致[8]。有关CA-Ⅱ作为结肠癌的抑癌基因更明确的机制尚待进一步研究。

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The expression of CA-Ⅱin colonic cancer and its clinical significance

WANG Guihong,ZHENG Landong
(Department of General Surgery,First Affiliated Hospital of Henan University,Henan Province,Kaifeng 475001,China)

Objective:To evaluate the expression of carbonic anbydraseⅡ (CA-Ⅱ)in colonic carcer associated with invasion,metastasis and biological behavior.Methods:The immunohisto-chemistry was used to detect the expression of CA-ⅡcDNA,and the changes of cell biological behavior was observed.Results:The positive rate of CA-Ⅱin side tissue of colonic cancer was 100%and in colonic cancer was 30%,the contrastive difference was visible(P＜0.05).The expression of CA-Ⅱ in colonic carcer was not related to age and sex(P＞0.05),and related to tissue type,different grade and lymph node metstasis(P<0.05).After transfection with human cDNA,the love cells changed obviously with reduction in invasion,chemotary motor ability and tolerance.Conclusion:The expression of CA-Ⅱin colonic cancer affect the invasion,metastasis and biological behavior.

Colonic cancer;Carbonic anhydvaseⅡ;Cancer

R574.62

A

1674-4721（2010）09（a）-005-02

王贵红（1971-），男，主治医师，在职研究生学历（郑州大学医学院2001级），从事普通外科肿瘤基础与临床研究。郑兰东，男，主任医师；研究方向：普通外科肿瘤基础与临床研究。

2010-07-12）