乙肝病毒携带产妇乳汁的HBV-DNA研究

朱云霞 ，张 华 ，邹怀宾 ，柳 鑫 ，李 卓 ，陈 煜 ，段钟平

（1.首都医科大学附属北京佑安医院妇产科，北京 100069；2.首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心，北京 100069）

乙肝病毒携带产妇乳汁的HBV-DNA研究

朱云霞1，张 华1，邹怀宾2，柳 鑫1，李 卓1，陈 煜2，段钟平2

（1.首都医科大学附属北京佑安医院妇产科，北京 100069；2.首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心，北京 100069）

目的：研究HBV携带产妇血清、乳汁及脐血中的HBV-DNA含量与其血清HBV标志物之间的关系，探讨HBV携带产妇乳汁的传染性。方法：对207例HBV携带产妇，采用电化学发光方法检测产妇的乙肝五项及采用荧光定量PCR技术检测HBV携带产妇血清、乳汁及脐血中的HBV-DNA含量。结果：125例HBsAg和HBeAg双阳性的产妇，其乳汁HBV-DNA阳性率为9.6%，82例HBsAg阳性但HBeAg阴性的产妇，其乳汁HBV-DNA阳性率为2.4%。两组乳汁HBV-DNA阳性率差异有统计学意义（χ2=4.027，P=0.045)；血清HBV-DNA<106copies/ml的产妇其产妇乳汁及脐血中HBV-DNA均为阴性。血清HBV-DNA≥106copies/ml的产妇其乳汁HBV-DNA阳性率为12.5%、其新生儿脐血阳性率为15.17%，与血清HBV-DNA<106copies/ml的产妇相比较差异均有统计学意义（P均<0.001）。结论：对于HBsAg阳性的产妇，HBsAg和HBeAg双阳性的产妇乳汁传染性高于HBsAg单阳性的产妇，血清HBVDNA≥106copies/ml的产妇乳汁传染性高于血清HBV-DNA<106copies/ml的产妇。

肝炎病毒；乙型；脐血；母婴传播；乳汁

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染目前仍是一个全球性的公共卫生问题[1]，乙型肝炎病毒核酸基因（HBVDNA）是反映HBV复制及传染性的直接指标，母婴传播是乙肝病毒的主要传播途径之一，关于产后母乳喂养是否引起HBV感染的重要因素的研究已受到医学界的关注[2-4]。本文对207例（2007年6月～2008年1月）在本院分娩并自愿参加此次临床研究的的HBV携带产妇的血清、乳汁及新生儿脐血血清进行HBV-DNA定量检测，对HBV携带产妇乳汁的传染性进行了探讨，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

207例HBV携带产妇为2007年6月～2008年1月在本院分娩并自愿参加此次临床研究的产妇,年龄19～39岁,平均28.6岁，肝功能丙氨酸氨基转移酶（ALT）均正常，无其他并发症。

1.2 标本采集及处理

1.2.1 孕妇外周血收集 所有检测对象均抽取静脉血3 ml注入试管，静置60 min，以3 000 r/min，离心20 min，分离血清，-80℃保存待检测HBV-M和HBV-DNA。

1.2.2 新生儿脐带血标本收集 阴道分娩或剖宫产术中，胎儿娩出断脐后，用2%碘酒消毒脐带，5 ml无菌注射器抽取3 ml脐动脉血，注入试管后送检。静置60 min，以3 000 r/min，离心20 min，分离血清，-80℃保存待检HBV-DNA。

1.2.3 乳汁标本收集 乳汁采集于产妇分娩后3～5 d，乳房局部清洗消毒，用一次性无菌容器采取乳汁2 ml，10 000 r/min，离心5 min，留取沉淀物加入无菌0.9%氯化钠溶液1 ml混匀，10 000 r/min，离心5 min，吸干上清液（用无菌0.9%氯化钠溶液洗涤沉淀物约3次），加入40 μl DNA提取液充分混匀100℃，10 min 10 000 r/min 离心 5 min， 吸取上清液 2 μl用于PCR反应，待检HBV-DNA。

1.3 检测方法、试剂和主要仪器

母亲乙肝五项均采用电化学发光方法，试剂购自美国Abbott公司，仪器使用美国Abbott公司i2000全自动化学发光免疫分析仪。

母亲血清、乳汁及脐血的HBV-DNA定量采用荧光定量PCR检测技术，试剂购自上海科华生物公司，仪器采用Fluo-Cycle实时荧光定量PCR仪。

1.4 统计学分析

采用SPSS 15.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇血清免疫学指标与乳汁HBV-DNA阳性的关系

HBsAg和HBeAg双阳性组产妇与HBsAg阳性但HBeAg阴性组产妇乳汁HBV-DNA阳性率差异有统计学意义（P=0.045），见表 1。

表2 孕妇血清HBV-DNA病毒载量与乳汁及新生儿脐血HBV-DNA阳性的关系

表1 产妇血清免疫学指标与乳汁HBV-DNA阳性的关系

2.2 产妇血清HBV-DNA病毒载量与乳汁及新生儿脐血HBV-DNA阳性的关系

207例产妇血清HBV-DNA<106copies/ml 95例，其产妇乳汁及新生儿脐血中检出HBV-DNA均为阴性。产妇血清HBV-DNA≥106copies/ml为112例，其产妇乳汁HBV-DNA阳性14例，乳汁HBV-DNA阳性率为12.5%，其中106水平有2例，107水平有2例，108水平有9例，109水平有1例。血清HBV-DNA≥106copies/ml组产妇与HBV-DNA<106copies/ml组产妇乳汁HBV-DNA阳性率差异有统计学意义（P=0.000）。产妇血清HBV-DNA≥106copies/ml其新生儿脐血中检出HBV-DNA阳性17例，HBV-DNA阳性率为15.17%。血清HBV-DNA≥106copies/ml组产妇与HBV-DNA<106copies/ml组产妇所分泌婴儿的脐血HBV-DNA阳性率差异有统计学意义（P=0.000），见表 2。

3 讨论

当今学术界认为HBV母婴传播主要的途径有3个，①宫内感染：HBV在胎盘内复制经血和（或）细胞传递是HBV宫内传播的主要途径。其传播的机制可能为，当HBV感染胎盘后，由HBsAg介导的免疫复合物反应使部分绒毛纤维素样坏死，通透性增加，导致病毒穿透胎盘屏障感染胎儿。②产道感染：当母体带有大量乙肝病毒时，乙肝病毒可通过宫内传播或分娩时胎儿吸入受污染的羊水、血及阴道分泌物或因微小的皮肤黏膜损伤致使含有HBV的母血进入胎儿循环导致感染（产道感染），所以要重视产时传播。③产后感染：众所周知，母乳是婴儿最理想的天然食品，但也可能是引起产后感染的重要因素。

金春子等[4]、罗世香等[5]报道，HBV携带者乳汁中检出HBV-DNA，母乳喂养可能是传播HBV的途径之一。因为HBV虽为嗜肝性病毒，但也侵犯其他细胞，淋巴细胞、精细胞中也发现有HBV-DNA的整合[6]。由于早期的母乳中存有大量淋巴细胞，故不能排除HBV-DNA在母乳中整合和复制成HBV的可能性。当新生儿或婴儿消化道任何一处（口腔、咽、食道、胃、肠道）黏膜因炎症发生水肿、渗出，导致通透性增加或黏膜直接破损时，母乳中的有害物质就可能通过毛细血管网进入血循环而引起乙肝感染。这种危险性也存在于耳、鼻、面部有破损的溢奶婴儿。

HBV-DNA是HBV的基因组成与复制模板，它的检出是HBV感染的直接依据，也是衡量传染性强弱的重要指标之一。因此，乳汁中HBV-DNA的浓度的高低与传染风险呈正相关。本研究结果显示：产妇血清HBV-DNA<106copies/ml时，其乳汁HBV-DNA为阴性，但当产妇血清HBV-DNA≥106copies/ml时，其乳汁HBV-DNA阳性率为12.5%。这一结果表明产妇血清HBV-DNA浓度≥106copies/ml时，乳汁具有传染性的可能性较大，其分娩的婴儿感染HBV的概率会增加，应同时检测乳汁HBV-DNA的结果，尽量避免哺乳。尤其是产妇血清和乳汁中HBV-DNA同时为阳性，新生儿血清HBV-DNA阴性，而幸免宫内感染，更应避免哺乳，以便预防产后的母婴传播。对于HBeAg阴性而血液和乳汁HBV-DNA阴性的产妇，在其婴儿接受主被动联合免疫后，乳汁具有传染性的可能性较小，可在医生的指导下考虑母乳喂养。高病毒载量的孕妇，新生儿脐血的病毒载量高。如果新生儿血清HBV-DNA阳性，证明新生儿已被感染，则母乳喂养利大于弊。游泳等[7]研究证明，脐血HBV-M及HBV-DNA检测结果与新生儿静脉血HBV-M及HBV-DNA检测结果相比较，差异无统计学意义，提示采用脐血检测了解胎儿宫内是否受乙肝病毒感染是可行的。

本实验中，新生儿脐血中HBV-DNA总阳性率为8.21%，产妇血清HBV-DNA浓度高者，其乳汁及脐血的阳性率也明显升高。所以，应注意HBsAg阳性妇女母乳喂养前应检测血HBV-DNA，复制活跃者应考虑采取人工喂养措施，以尽量减少母婴传播的危险。由于HBV在产妇的初乳中即可能排出，这对从新生儿起预防HBV感染提出了新要求。HBV携带产妇准备母乳喂养者，在进行母乳喂养前需检测乳汁中的HBV-DNA定量，这可能是预防和阻断产后HBV母婴传播的有效措施之一。

[1]World Health Organization.Hepatitis B.World Health Organization Fact Sheet 204 dex.(Revised October 2000).WHO Web site[OL].http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/in html.

[2]Yao JL.Perinatal transmission of hepatitis B virus infection and vaccination in China[J].Gut,1996,38(1):S37-38.

[3]林坚,廖莳,王春平.乙型肝炎病毒DNA定量检测与母婴传播的研究[J].中华围产医杂志,2000,3(4):211-213.

[4]金春子,贾卉.132例乳汁中HBV-DNA PCR检测结果分析[J].中国优生与遗传杂志,1997,5(5):20-22,26.

[5]罗世香,焦存仙.检测孕妇血清、乳汁及新生儿血清乙肝标志物的优生学意义[J].中国优生与遗传杂志,2000,8(2):74,115.

[6]Feinman SV,Berris B,Guha A,et al.DNA:DNA hybrization method for the diagnosis of HBV[J].J Viral Meth,1984,8(3):199-206.

[7]游泳,邢爱耘,郑莹,等.脐血与新生儿静脉血检测乙型肝炎病毒标志物及 DNA的对比研究[J].四川大学学报(医学版),2005,36(2):290-291.

Study on HBV DNA in breast milk in pregnant women with HBV carrier

ZHU Yunxia1,ZHANG Hua1,ZOU Huaibin2,Liu Xin1,Li Zhuo1,CHEN Yu2,DUAN Zhongping2
(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Beijing You′an Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China;2.Artificial Liver Center,Beijing You′an Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

Objective:To study the relationship between the load of HBV-DNA in serum and breast milk and the serum HBV makers of pregnant women with HBV carrier,to explore the infectivity of breast milk in pregnant women with HBV carrier.Methods:A total of 207 pregnant women with HBV carrier and their neonates entered the study.Serum HBV-markers of the women were detected using electrical chemiluminescence immunoassay,the load of HBV-DNA in serum and breast milk of the women and in umbilical cord blood of the neonates were tested by real-time quantitative polymerase chain reaction.Results:The positive rate of HBV-DNA in breast milk was 9.6%and 2.4%in HBeAg-positive mothers group and HBeAg-negative mothers group,respectively(χ2=4.027，P=0.045),the positive rate of HBV-DNA in breast milk was 12.5%and in mothers with HBV-DNA≥106copies/ml and mothers with HBV-DNA<106copies/ml,respectively,the positive rate of HBV-DNA in umbilical cord blood was 15.17%and in neonates born to mothers with HBV-DNA≥106copies/ml and mothers with HBV-DNA<106copies/ml,respectively(P all<0.001).Conclusion:For the pregnant women with HBV carrier,mothers with HBeAg positive or HBV-DNA≥106copies/ml can increase the infectivity of breast milk.

Hepatitis B virus;Umbilical cord blood;Mother-to infant transmission;Breast milk

R512.6+1

A

1674-4721（2010）09（a）-007-03

张华（1955-），女，主任医师；研究方向：乙型肝炎的母婴阻断。段钟平，男，主任医师；首都医科大学附属北京佑安医院副院长，北京市人工肝治疗培训中心主任，卫生部中国肝炎防治基金会治疗及预防技术咨询中心副主任；担任中华肝病学会常委，中华肝病学会重肝与人工肝学组组长，中华医院管理学会血液净化分会常委，担任多家学术专业杂志的编委或常务编委，北京市和科技部肝病重大科技攻关项目首席专家，全国人工肝及血液净化攻关协作组组长；曾到多个国家进行访问交流，发表学术论文40多篇，出版著作5本，获得卫生部等成果9项。

2010-07-20）